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Gene Tools靶向Morpholino寡核苷酸比靶向基于DNA的反义寡核苷酸要简单得多。如果将吗啉成功地递送到细胞质中，通常会进行首次尝试。DNA和S-DNA寡核苷酸在首次尝试中关闭目标基因的可能性很小；在找到有效序列之前，通常尝试五到六个寡核苷酸。部分原因是吗啉寡核苷酸具有更高的结合亲和力而不是等同的基于DNA的反义寡核苷酸。这种较高的亲和力使Morpholinos能够侵入RNA二级结构，并大大提高了设计有效寡核苷酸的可能性。精确靶向单个基因也得到了简化，因为吗啉代寡核苷酸通过位阻作用而不是RNAse H介导的mRNA降解机制。我们将在本节中进一步描述亲和力和位阻效应。
回答有关您的实验系统的几个问题，将有助于您设计针对目标靶点的特异且高效的吗啉序列。设计出色的Morpholino寡核苷酸并不需要所有这些问题的详尽答案，但是，您对目标的了解越多，成功的机会就越大。相关问题包括：mRNA或pre-mRNA的结构是什么？我想阻止剪接形式或剪接位点吗？我在起始密码子和上游是否有足够的序列来设计一个或多个翻译阻断型吗啉寡核苷酸？靶序列是否与不良基因靶具有同源性？我的学习有哪些实验条件（例如温度和时间限制）？除了上述定位问题之外，您应该牢记这两个对于总体实验设计很重要的问题：如何检测成功的基因敲低？我如何将寡核苷酸递送到细胞质中？
一旦找到了可行的靶标区域并选择了有效的胞质递送方法和用于测定反义活性的方法，Morpholino寡核苷酸序列将决定成功。重要的是，寡核苷酸必须具有几乎没有自身互补性的碱基序列，以使其不二聚。否则，最佳的吗啉代寡核苷酸将长约25个碱基，并具有足够高的GC含量（例如40-60％），从而具有很高的目标亲和力。寡聚物不应具有四个或更多的连续G链段，以保持水溶性。
在最典型的情况下，完整的mRNA序列是已知的，人们希望阻止其翻译。对于此应用，最佳靶标是25个碱基的序列，该序列位于5'帽到编码序列的前25个碱基的区域内，GC含量约为50％，几乎没有或没有二级结构。除了具有内部核糖体进入位点（IRES）的基因的异常情况外，靶向起始密码子而不是上游序列没有特别的优势。
通常，人们可以在5'帽以内找到至少2或3个寡核苷酸靶，以起始具有大致相同性质的区域。与任何这些靶标互补的寡核苷酸应减少下游编码区的表达。在针对给定基因的任何寡核苷酸中，很可能存在“最佳”寡核苷酸，其可实现最大的敲除，有时达到无法检测到的基因表达水平。在许多情况下，仅尝试一个寡核苷酸就足以有效击倒。没有其他反义结构类型可以达到Morpholino寡核苷酸使用者成功完成首次尝试敲除的高比例。
Morpholino寡核苷酸靶向的成功率很高，可能是由于它们对RNA的亲和力更高。与低亲和力的S-DNA相比，Morpholinos入侵RNA的二级结构要成功得多。反义领域的一个长期问题是难以预测反义寡核苷酸的有效靶标。具体而言，S-DNA对所选RNA中的许多潜在靶序列无活性。这可能是因为弱结合的S-DNA无法侵入RNA中相对稳定的二级结构。即使当RNA中合适的单链区域可用于配对时，低亲和力S-DNA常常也无法侵入相邻的双链区域。通常，对几套S-DNA寡核苷酸进行筛选，以找到能够敲除其靶基因的单个寡核苷酸。通常，Morpholino用户购买了一个寡核苷酸并敲低了一个基因；大约80％的时间，第一个Morpholino尝试执行此操作。
Morpholinos的良好靶向可预测性通过图1a和1b中所示的实验证明。这些实验中靶向的mRNA具有相当稳定的二级结构，但吗啉代寡核苷酸仍能实现良好的敲低。图1a显示了包含与萤火虫荧光素酶的氨基酸编码序列连接的乙型肝炎病毒（HBV）mRNA前导序列的85个碱基的mRNA构建体。编号的线表示7种不同的吗啉代反义寡核苷酸的靶位点。图1b显示了在无细胞翻译测定中使用1纳摩尔靶标mRNA实现的翻译敲低。图1a中显示的每种Morpholino寡核苷酸均以1微摩尔浓度使用，其击倒功效在图1b中作为其沿mRNA位置的函数绘制，以及与平移起始位点相距3'的另外5个寡核苷酸的对应值。尤其值得注意的是，寡核苷酸3、4和5被认为有效侵入了HBV前导序列内相当稳定的二级结构。
图1. RNA结构和吗啉反义活性
应当指出，Morpholinos靶向AUG翻译起始位点3个以上碱基的低效力可能是在翻译起始位点完全组装后与核糖体复合物相关的解旋酶活性的结果。如我们在特异性部分中所述，针对翻译起始位点3个以上碱基的序列缺乏效力实际上实际上导致了Morpholinos相对于S-DNA，RNAi和嵌合寡聚物的特异性更高。
图1b中的结果表明，通过遵循合理且可靠的靶向指南，可以选择具有较高有效可能性的吗啉代反义寡核苷酸。这些定位准则将在下面详细介绍。
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Gene Tools制备亚基合成制备Morpholino寡核苷酸的第一步是将核糖核苷转化为Morpholino亚基，如图1所示。图1.核糖核苷向吗啉代转化随后用三苯甲基保护吗啉亚基，并用我们的氨基磷酸酯连接剂激活，如图2所示。图2.吗啉亚基的保护和激活Oligo大会如图3所示，我们使用一个简单的两次反应循环，并在中间进行洗涤，将活化的亚基组装到固相支持物上具有确定序列的寡核苷酸。第一反应需要添加活化的亚基。第二个反应需要去三苯甲基化，以准备链末端用于下一个亚基的添加。图3. Oligo组装周期寡核苷酸加工浓NH 4 OH用于从树脂上裂解低聚物并从核碱基中除去保护基。通过过滤和选择性沉淀来清理完成的寡核苷酸。将寡核苷酸重新悬浮在纯水中。取等分试样用于MALDI-TOF质谱，并且另一等分试样在0.1N HCl中于265nm分光光度法定量。在酸性pH值下拍摄UV光谱，以防止由于碱基堆积而导致的低色度导致的误差。该紫外光谱定量的值用于计算寡核苷酸浓度，然后将300纳摩尔寡核苷酸放入样品瓶中并冷冻干燥。将小瓶密封并烘烤以得到无菌的冻干寡核苷酸。要使用这种寡核苷酸，只需简单地添加一定量的无菌水即可形成无菌的预定量储备液，准备将其用于反义实验中。