ChromoTek 常见问题解答

1、GFP-Trap®可识别的GFP衍生物类型有哪些？
    (1) eGFP, wtGFP, GFP S65T
(2) TagGFP
(3) eYFP, YFP, Venus, Citrin
(4) CFP
不能识别：TurboGFP，所有的RFPs
 
2、RFP-Trap®可识别的RFP衍生物类型有哪些？
(1) mRFP
(2) mCherry
(3) mOrange
(4) mPlum
(5) mRuby
(6) mKate2
    不能识别：DsRed、mRFPruby、TagRFP、所有GFPs
 
3、Nano-Trap® (GFP-Trap® / RFP-Trap®) 的结合能力如何？
    Nano-Trap®的结合能力取决于珠子。每10μL浆液，琼脂糖珠可结合2~3μg GFP，磁性颗粒可结合0.25-~0.5μg GFP。
 
4、可以从GFP-Trap洗脱结合蛋白么？
    关于定量洗脱，可以将样品至于SDS上样缓冲液中95℃煮10min（详见protocol），或者在0.2 M的甘氨酸（pH2.5）中孵化0.5~2min，随后用0.1体积的1M Tris碱中和。

5、是否可以从GFP-Trap洗脱出自然状态的结合蛋白，比如，在凝胶迁移实验或功能分析实验中？
    可以尝试洗脱游离的GFP。但是，请注意，这种方法，不能定量洗脱出目标融合蛋白。
 
6、怎样才能避免非特异性的蛋白与GFP-Trap交互作用而结合？
    关键操作步骤，是在孵化液中稀释洗涤剂的浓度。我们建议，洗涤剂为终浓度0.1%（如NP-40 或TX-100），且最终体积不少于0.4mL。另外，我们建议，要测定各种洗涤缓冲液的盐浓度，使其范围在150mM-500mM范围内，以去除非特异性结合的亲水性蛋白。

7、在binding过程中，N-端与C-端GFP融合蛋白之间是否存在差异？
    GFP-Trap®对C-末端的GFP融合蛋白的亲和力稍高，若要消除这种差异，可以加长孵化时间（1-2h取代15-30min）
 
8、是否可以在组织样品（即变性缓冲液）中直接纯化GFP标记的融合蛋白？
    原则上，GFP-Trap®即使在恶劣的缓冲条件下（如，RIPA缓冲液，含0.1%SDS或1M尿素），也非常稳定。
 
9、可结合的GFP-Trap®珠的GFP结构，是否有大小限制？
    无。
 
10、如果在洗脱液中，有剩余的背景怎么办？
    建议使用Chromotek的blocked particles（bab-20 or bmp-20）对样品进行预处理。