Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品（一）

货号：	暂无
是否单克隆：	0
抗原来源：	0
宿主：	0
数量：	大量

Santa Cruz生物技术公司为第一抗体提供了高品质的支持产品。包括用于WB和IHC的自产的第二抗体，用于IP研究的发光试剂，琼脂糖标记proteinA，proteinG PLUS和proteinL，用于WB的胞核提取，全细胞溶解物，组织提取试剂，WB膜，TransCruz凝胶迁移寡核苷酸，封闭物和实验室常用试剂。提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量标准和预染分子量标准。ImmunoCruz染色系统用于IHC（石蜡切片）染色，为预稀释，即用系统。还介绍一系列凋亡检测试剂盒。支持产品主要涵盖以下方面：1）WB 2）IP 3）IP/WB 4）免疫复合蛋白激酶检测 5）免疫过氧化物酶细胞染色 6）免疫荧光细胞染色 7）流式细胞技术（FCM）8）ELISA检测 9）TransCruz凝胶超迁移实验 10）用多肽中和抗体活性的方法 11）染色质免疫沉淀（ChIP）实验 12）siRNA转染 13）半定量RT-PCR 14）溶液配制。

1. WB

A.样品准备
注意：细胞培养基产品包括经典和特殊培养基，血清，培养基添加物，诱导物，抗生素。产品列表和代理商信息请登陆网站www.scbt.com。

单层细胞
l 室温下，移去培养基并用PBS冲洗直径100mm的培养皿。以下步骤均在冰上或4℃操作，使用冰预冷的新鲜缓冲液。
l 加入0.6ml RIPA裂解液（sc-24948）。4℃轻轻晃动细胞培养皿15min。用细胞刮将贴壁细胞刮下。转移裂解液至微量离心管内。
l 用0.3ml RIPA裂解液洗一次培养皿，将洗液与之前的溶解物合并。（可选择：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液和/或用21号注射器针头切割DNA）冰上孵育30-60min。
l 将细胞溶解物4℃离心，10000×g，10min。转移汉细胞裂解物的上清至新的离心管内，弃沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

悬浮细胞
l 室温低速离心5min，收集约2.0×107个细胞。小心除去培养基。
l 室温下用PBS冲洗细胞沉淀，再次低速离心5min，小心除去培养基。
l 加入1.0ml冰预冷的RIPA裂解液（sc-24948），裂解液中现用现加入蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂。用移液器轻轻悬浮细胞，冰上孵育30min。
l 用21号注射器针头、杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化。注意不要使裂解物温度过高。（可选择：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液。）冰上孵育30min。
l 将裂解液转移至离心管，4℃离心，10000×g，10min。转移上清至新的离心管内，弃去沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

组织样品
l 称重组织块，并用干净的剃刀剪碎。冰冻组织可被切的很薄，并在含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（sc-24948）中解冻。3ml冰预冷的RIPA/g组织。
l 杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化，温度维持在4℃。（可选择：加入30μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）储存液/g组织。）冰上孵育30min。
l 将裂解液转移至离心管，4℃离心，10000×g，10min。弃沉淀。可加长离心时间获得更好的裂解产物。

注意：涉及磷酸化作用研究时，可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

B电泳

l 将样品（每个泳道全细胞提取物40-60μg，胞核提取物10-20μg或10-20ng纯化蛋白）与等体积2×电泳上样缓冲液(sc-24945)混合，煮沸2-3min。未用完的样品可保存在-20℃。
l 上样，10μl/1.0mm×0.75mm孔。
l 推荐使用Cruz MarkerTM分子量标准（sc-2035）。小胶（0.75mm）每孔上样2μl，大胶（1.5mm）每孔上样5μl。如用与Cruz MarkerTM一致的第二抗体，可看到用于检测试剂的内参条带。也可选择预染分子量标准（sc-2361）。
l 电泳步骤参考标准protocols。
l 根据厂家protocols，用电转装置将蛋白条带转移至NC膜或PVDF膜上。

注意：Cruz Blot SystemTM提供预制好的人或小鼠全细胞提取物和核提取物，或小鼠组织提取物。

C。Immunoblotting
l 用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗体时建议使用BSA）封闭膜上的非特异位点，室温孵育30-60min。也可选择用不含Tween-20的Blotto，在封闭容器内4℃过夜孵育。
l 如果使用的是磷酸化特异抗体，建议向封闭液和抗体稀释液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。
l 封闭好的膜与第一抗体（Blotto稀释）稀释液室温孵育1小时。（如果是磷酸化特异抗体，要用加了50 mM NaF的Blotto稀释液。）抗体最佳浓度根据滴度决定。建议起始稀释度为0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。
l 将膜与HRP或AP标记的第二抗体稀释液（Blotto稀释）室温孵育45min，稀释度1:500-1:2000。如果背景过高，第二抗体需进一步稀释（可达1:20000）。作ECL时，如果使用Cruz MarkerTM分子量标准（sc-2035），必须使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作为可视化标准。
l TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。
l 将膜与化学发光试剂（sc-2408）孵育。如果发光化合物用于可见光检测，必须用HRP标记的第二抗体。

2．IP

注意：本操作步骤可用于放射性或正磷酸盐标记的细胞。(放射性物质的使用及处理应遵循适当的条例如OSHA和NRC指导手册。)细胞标记必须在无待标记氨基酸残基或无磷酸盐的培养基中进行。建议标记前使细胞处于适当的饥饿状态。孵育培养细胞（100mm细胞培养皿上约80-90%
单层细胞汇合或培养瓶内含约2-5×107个悬浮细胞）。通常，用传代贴壁细胞或2-5×107个悬浮细胞可得到最优标记。

例如：除去培养基，加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的无蛋氨酸培养基。37℃孵育1h。某些蛋白需延长标记时间（18hrs）。有必要用PBS洗涤细胞除去未结合的放射物。

l 向单层传代细胞中加入1-3ml冰预冷的RIPA（sc-24948），4℃孵育10min。对于悬浮细胞则向离心管中加入RIPA洗涤细胞沉淀。
l 用21号注射器针头或超声波反复裂解细胞。转移裂解物至微量离心管中。
l 可选择：用1.0ml冰预冷的RIPA冲洗细胞培养皿，与之前的合并处理。
l 4℃，10000×g离心10min。冰上转移上清（细胞溶解液）至新的微量离心管。
l 预处理细胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（与第一抗体的种属来源一致）和20μl悬浮的（25%v/v）琼脂糖偶联物（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。4℃孵育30min。
l 2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。
l 转移上清或约100-1000μg总细胞蛋白至微量离心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）第一抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。或者，可加入20μl第一抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜；跳过下一步骤。
l 加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
l 2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。
l 用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。
l 最后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。
l 样品煮沸2-3min，上样电泳分离免疫复合物，通过放射自显影观察结果。未用完的样品可保存在-20℃。
l 可选择：煮沸后，样品可经离心沉淀琼脂糖颗粒，然后SDS-PAGE分析上清。

3．IP/WB

l 按照之前描述的WB程序准备总细胞溶解物。

注意：如进行磷酸化研究，溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒（sc-24964）富集磷酸化蛋白。

l 预处理全细胞溶解物（可选择步骤），约1ml全细胞溶解物或组织提取物，加入0.25μg适当的control IgG（与第一抗体种属来源一致）和20μl悬浮的（25%v/v）琼脂糖偶联物（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。4℃孵育30min。
l 2500rpm（约1000×g），4℃离心30s。转移上清（细胞溶解物）至干净的微量离心管。
l 1ml细胞溶解物或约100-1000μg总细胞蛋白，加入10μl第一抗体琼脂糖偶联物，混匀，4℃孵育1hr-过夜。
l 可选择：如无第一抗体琼脂糖偶联物，1ml细胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）第一抗体（抗体浓度应滴定测定），4℃孵育1-2hrs。加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好管子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
l 2500rpm（约1000×g），4℃离心30s，收集免疫沉淀物，小心吸弃上清。
l 用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次，每次重复以上离心步骤。
l 最后一次洗涤后，小心吸弃上清，用40μl 2×电泳上样缓冲液（sc-24945）重悬沉淀。
l 样品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上样孔上样5-10μl。
l 电泳并按WB程序作免疫杂交。

注意：选择不同的第二抗体，55kDa重链和27kDa轻链IgG，可检测到第一抗体。如果以上步骤中采用第一抗体琼脂糖偶联物则第一抗体条带不明显。

4．免疫复合蛋白激酶测定
l 从100mm细胞培养皿（单层细胞80-90%汇合）移除培养基，PBS洗一次。
l 加入1-3ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解缓冲液对某些激酶效果不好。需要优化裂解液成分来保持激酶活性。）
l 用21号注射器针头反复抽吸使细胞破碎充分，转移至15ml离心管中。
l 用1ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液，0.5%Triton X-100（sc-29112）冲洗培养皿，与原裂解液合并。
l 10000×g，4℃离心10min。4℃转移上清至新的离心管内。
l 转移1.0ml细胞提取物（上清）至1.5ml离心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）第一抗体（抗体最佳浓度经滴定测定），4℃孵育1hr。
l 加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液（（A蛋白-琼脂糖，G蛋白-琼脂糖，A/G蛋白-琼脂糖，或L蛋白-琼脂糖）。盖好盖子，4℃振摇孵育1hr-过夜。
l 2500rpm（约1000×g），4℃离心5min，收集免疫沉淀复合物。小心吸弃上清。
l 1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重复上述离心步骤。
l 20μl适当的蛋白激酶缓冲液重悬沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巯基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。缓冲液成分根据所研究的激酶调整。
l 加入10-1000ng多肽底物。该底物/酶/细胞系的多肽底物浓度应根据经验决定。
l 准备1ml ATP混合物：930μl适当的蛋白激酶缓冲液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每个样品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。
l 加入等体积2×电泳上样缓冲液（sc-24945）终止反应，样品煮沸2-3min。样品可离心沉淀琼脂糖微珠（可选择）；分析上清。跑SDS-PAGE，通过放射自显影观察结果。未用完的样品保存在-20℃。检测中如用小肽底物，样品必须通过闪烁计数或其他标准方法而不是SDS-PAGE来分析。

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司,免费热线:400-698-4168。 业务咨询 QQ :1213084081