一表看懂，为什么 BCA 定量法是蛋白定量热门？

蛋白质定量是生物学研究领域中不可或缺的一环，凡是与蛋白质分析相关的实验，皆须确定蛋白质样本的含量与浓度，才可进行下一步分析。因此，如何取得准确的蛋白质定量数据是生物学研究中最基础却也是最关键的决定性步骤。
 
蛋白质定量方法

	BCA	Lowry	Bradford	UV
原理	BCA (bicinchoninic acid)混和碱性硫酸铜溶液，加入蛋白样品后，二价的Cu2+会被蛋白质还原成单价的Cu+，而与BCA形成紫色的复合物，在562 nm左右有吸光值	Lowry与BCA原理很类似，为传统方法。在碱性条件下，铜離子与蛋白质形成复合物，于后续步骤将Folin reagent 内的phosphomolybdic-phospho- tungstate 还原而使溶液变为蓝色，此蓝色复合物在750 nm左右有吸光值	在酸性溶液中，Coomassie Brilliant Blue G-250会与蛋白质结合，并使溶液颜色由棕紫色转变成亮蓝色，此蓝色复合物在595 nm左右有吸光值	带有芳香基团的氨基酸，如：苯氨基丙 (phenylalanine)、酥氨酸 (tyrosine) 与色氨酸 (tryptophan)，其吸光波长约在260-280 nm左右
灵敏度	0.02~2 mg	0.05~0.5 mg	0.01~0.05 mg	0.05~2 mg
优点	灵敏度范围广 不易受去污剂干扰 特别适合膜蛋白定量	灵敏度高	低浓度灵敏度高 简单快速 不易受还原剂干扰	灵敏度范围广 简单快速 不须搭配其他反应试剂
缺点	对还原剂耐受性较低，例如：DTT、2ME、TCEP	耗时较长 Folin reagent在碱性环境下不稳定，需要精确控制反应时间 标准曲线非严格的直线形式 专一性较差，易受硫酸铵、钾离子、镁离子、EDTA、Tris、硫醇化合物 (thiol reagent) 与碳水化合物的干扰	易受去污剂干扰：例如Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH 蛋白质分子量若小于3000 Da 不利呈色	易受核酸与其他缓冲液干扰 不同的蛋白质 会因为在分子上芳香胺基酸的数目与种类不同，而导致280 nm 吸光就有极大的差别

 
 
BCA 蛋白定量法揭密
 
科学家Stoscheck于1990年建议以BCA 分析取代传统的Lowry 方法分析蛋白，主要的原因是BCA 法只需一步反应，且试剂于碱性条件下较安定。目前BCA (bicinchoninic acid) Protein Assay是最常见的蛋白定量方法，市售BCA 定量试剂盒为两剂型，试剂A 含有 BCA，试剂B则含有硫酸铜 (CuSO₄)。使用前混和两种试剂，在碱性环境下，蛋白质可将二价铜离子Cu²⁺还原为两个单价铜离子Cu⁺，而一个Cu⁺可螯合两个BCA分子，使试剂颜色由苹果绿转变为紫色，此专一性呈色与蛋白质浓度成正比，透过检测562nm 的吸光值，并比对标准蛋白 (例如：BSA) 的校正曲线，可取得蛋白质浓度定量数据。
 

 
BCA 定量优点：

1. 灵敏度范围广，可达0.02~2 mg。
2. 实验操作步骤容易。
3. 操作时间只需45分钟，可快速取得定量结果。
4. BCA 对去污剂 (detergent) 具有高耐受性，不易受其影响。

 
BCA蛋白定量试剂盒挑选重点：
Step 1: 建立BSA/BGG蛋白标准曲线，确认定量线性范围
采用 Visual Protein Standard Protocol for Microplate：37℃ 作用30分钟

 
Step 2: 确认常见的去污剂是否会影响标准曲线的线性关系
采用 Visual Protein Standard Protocol for Microplate：37℃ 作用30分钟

 
Step 3: 确认低蛋白浓度 (5-250 μg/mL) 定量是否准确
采用 Visual Protein Enhanced Protocol for Microplate：60℃ 作用30分钟

 
参考数据：

1. Stoscheck, CM.1990. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
2. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K.,

Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal.
Biochem 150:76-85
 
 
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