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一、Klentaq1/KlentaqLA?

实例1：用KelntaqLA扩增大于20kb的大片段基因。
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二、高耐受性(Inhibitor-Resistant)聚合酶：OmniTaq/OmniKlentaq
产品特征：
1.对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性，可直接对样品进行PCR检测，无需进行DNA分离纯化。
2.可以耐受高达40%的全血，20%的血浆或血清，已应用于多种遗传病的分子诊断和临床检验。
3.可用于法医、环境监测、农业、动植物检疫和临床诊断等领域。
4.可以从人血液中一步扩增疟疾基因。
5.与PCR增强剂结合使用时，其耐受性将进一步提高。
6.使用Omni酶不仅节省时间、降低成本，而且实现了从微量样品中的扩增，避免因提取过程所致的DNA丢失或污染。

实例2：用OmniTaq（OT）和OmniKlentaq（OKT）从肝素抗凝血液中一步扩增乙肝病毒基因。
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实例3：用新突变的Omni酶从富含腐殖酸的人基因组中扩增1.1kb的CCR5基因。
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实例4：用新突变的Omni酶从巧克力和黑胡椒中直接扩增基因。

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三、热启动聚合酶(Hot-start)聚合酶：CesiumTaq/CesiumKlentaq
产品特征：
1.CesiumTaq和CesiumKlentaq是一种冷敏感的突变体，在室温条件下聚合酶的活性很低，当升高温度进入PCR循环时聚合酶的活性就全部释放出来，因而具有内置式热启动功能。
2.与现有化学修饰或抗体封阻的热启动聚合酶相比，CesiumTaq和CesiumKlentaq的聚合酶活性更高，扩增效果更好。
3.CesiumKlentaq具有热启动和高耐受性双重效果。

实例5：用CesiumKlentaq扩增基因热启动效果比较

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四、PCR增强剂（PCRenhancingcocktails,PEC）
产品特征：
1.联合使用PEC-1或PEC-2与高耐受性Taq酶（OmniTaqandOmniKlentaq）可以更好的克服样品中各种物质对PCR反应的抑制作用，进一步提高PCR扩增效率，简化PCR操作流程提高。
2.PEC有助于从基因组中扩增GC含量高达80%的基因。
3.PEC也可用于qPCR（SYBR和Taqmanprobe）。
4.新研发的PCR增强剂PEC-3andPEC-4有助于从食品中扩增基因。

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实例6：联合使用OmniTaqorOmniKlentaq及PCR增强剂（PEC）从不同类型的牛奶中检测沙门氏杆菌Inv基因。
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实例7：联合使用OmniTaqorOmniKlentaq及PCR增强剂（PEC）从人的基因组DNA或全血中直接扩增3个高GC含量的基因。
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五、各种特异性一步PCR试剂盒
VitaNaviTech公司开发了系列一步法PCR和qPCR试剂盒，可以直接从样品中扩增目的基因。

1.DirectBloodPCRKit：从血液中直接扩增目的基因

实例8：使用DirectBloodPCRKit从全血中一步扩增CCR5基因

[0069]PCR运行仪器为ABIStepOnePlusthermalcycler，反应条件为:预变性95°C5分钟，变性95°C10s，退火60°C40s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。数据分析使用GraphPadPrism5软件，检验方法为two-tailedStudent’stest。最终结果用平均值土SD(标准差）表不。

[0070]结果表明，血清和血浆样本都可用于miRNA直接定量RT-qPCR检测，但是血浆中miRNA检测Ct值全部显著低于血清，说明miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图5)。

[0071]对比例l、S-Poly⑴Plus方法检测循环miRNA

[0072]S-Poly⑴Plus法检测循环miRNA需要提取核酸，包括以下步骤：

[0073](一）、提取血清/血浆总RNA

[0074]在本实施例中提取血清/血浆总RNA，具体步骤为：

[0075]1)0.IpM线虫miRNAcel-miR-54作为内参提前加入ImL的RNAiso-Plus(TaKaRa)中，加入IOOyL血清/血浆，吹打混匀，室温静置5分钟；加入200yL氯仿，盖紧离心、管盖，剧烈振荡20秒;室温静置5分钟；

[0076]2)12,000g，4°C离心15分钟；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的上清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相;吸取500yL上清液转移至另一新的1.5mL离心管中；

[0077]3)向上清液中加入5yL适当浓度的糖原(Applichem)溶液，使糖原终浓度为15yg/mL，再加入与等体积的异丙醇(505μ〇，上下颠倒充分混匀，-20°C或-80°C静置至少10分钟；

[0078]4)13，500g，4°C离心10分钟；弃去上清液，向沉淀中加入ImL的75%乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13，500g，4°C离心5分钟，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并弃尽上清；

[0079]5)沉淀室温干燥2〜3分钟，加入IOOyLRNase-freeWater溶解，溶解产物置于-80°C储存，或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。

[0080](二）、S-Poly⑴Plus法检测miRNA

[0081]S-Poly⑴Plus法检测miRNA，使用逆转录引物和qPCR引物同实施例1表1，包括以下步骤：

[0082]Sl、加尾逆转录:miRNA加Poly(A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0083]加尾逆转录的反应体系包含：4yL血清总RNA，lyL的0.05μΜRTprimer(逆转录引物），IU的PolyAPolymerase(多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV(鼠白血病逆转录_，2.5yL的reactionbuffer(反应缓冲液），RNase_freeWater(无RNA酶水）补足至10yL。所述reactionbuffer包含200mMTris-HCl，600mMNaCl，40mMMgC12,4mMATP，2mMdNTP，pH8.0。加尾逆转录的反应条件为:37°(：保温3〇1^11，42°(：保温3〇1^11，75°(：保温51^11以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0084]S2、以步骤Sl中逆转录获得的第一链cDNA为模板，Real-timePCR定量检测采用探针法，所用探针为通用探针，其序列同实施例UReal-timePCR的反应体系如下：

[0086]PCR运行仪器为ABIStepOnePlusthermalcycler，反应条件为:预变性95°C3分钟，变性95°CIOs，退火60°C30s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。本实施例中相对表达量用2_~ACt计算。数据分析使用GraphPadPrism5软件，检验方法为two-tailedStudent’stest。最终结果用平均值土SD(标准差)表示。

[0087]结果表明，血清和血浆样本都可用于S-Poly(T)Plus法检测miRNA的模板，但是血浆中miRNA相对表达量显著高于血清，再次验证miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图6)ο

[0088]实施例2本发明的DirectS-Poly⑴Plus(DSPP)方法中不同裂解方案的效果比较

[0089]在DirectS-Poly(T)Plus方法中，可选用以下六种处理方式中的任一种实现miRNA从蛋白复合体中裂解出来：

[0090]①裂解体系：20ul裂解液、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟；

[0091]②裂解体系：20ulRNase-freewater、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟；

[0092]③裂解体系：20ul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条件：50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟；

[0093]④裂解体系：20ul2Xlysisbuffer、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟；

[0094]⑤裂解体系：20ul2Xlysisbuffer、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟；

[0095]⑥裂解体系：IOul2Xlysisbuffer、IOul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条件:50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。

[0096]上述处理方式中所述的裂解液包括以下终浓度的组分：2.5%的tween-20，50mMTris和ImMEDTA;所述2Xlysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pH为8.0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0097]其他操作同实施例1。

[0098]实验结果显示，在上述方案中，单独使用tween20(裂解液的主要功能成分，详见参考文献ZhangQ，0ncotarget，2016,7(16):21865-21874)、蛋白酶K或者二者同时使用的效果都差强人意（分别对应方案①，②，③）。在方案⑤中，使用2Xlysisbuffer和蛋白酶K的组合，miRNA的Ct值最小，与方案③相比，降低了0.8〜6.8。方案⑤和⑥对比实验，表明可能tween20在裂解miRNA包裹蛋白复合物的同时，也能对poly(A)/RT反应造成不利影响（图2)。因此，方案⑤在本发明中被推荐为最优方案，裂解反应血浆用量为20〜50ul。

[0099]实施例3DirectS-Poly⑴Plus方法中一步法和两步法灵敏度对比

[0100]在之前的发明S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号：201510558101.5)，以纯化的RNA为模板，一步法灵敏度比两步法大大提高。两步法即miRNAPoly㈧加尾完成后再进行逆转录;一步法即miRNA的Poly㈧加尾和逆转录在同一反应中进行。在本次发明中，以粗提RNA为模板，操作同实施例1，两步法与一步法的灵敏度再次比较。如图3所示，在DirectS-Poly(T)Plus方法中，本发明方案使一步法的灵敏度比其两步法提高了2.5〜52倍（1.7〜5.7个Ct值差距）（图3)。

[0101]实施例4miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术体系起始粗提RNA加入比例效果对比

[0102]粗提RNA可能含有一些抑制Poly(A)加尾和逆转录酶活性的成分，因此在DirectS-Poly⑴Plus方法中粗提RNA加入的起始量对方法灵敏度的存在一定影响，采用不同的粗提RNA起始量，试验操作同实施例1，试验结果如图4,可以看出，当粗提RNA的起始量体积百分数从0.5%增长至40%时，miRNA的Ct值线性降低。但是当粗提RNA加入的比例升高至60%和75%时，miRNA的Ct值出现了回复升高。在本发明中，40%的粗提RNA起始量被推荐为最佳比例。

[0103]实施例5、热启动DNA聚合酶在DirectS-Poly⑴Plus方法中的作用测试

[0104]在DirectS-Poly(T)Plus方法体系中，没有RNA的纯化，可能会引入一些基因组DNA的污染，因此在qPCR中，更容易出现与基因组DNA的错配。减少非特异性扩增的一个有效方法是热启动，即在热循环开始之前防止或者减少DNA的合成。本实施例对DirectS-Poly⑴Plus方法中PCR部分所用的普通DNA聚合酶和热启动DNA聚合酶做了对比分析。本实施例中采取了一种有效的形成热启动的方法，即Taq酶抗体，抗体与DNA聚合酶结合，在热循环开始之前，酶活不会被启动。本实施例中采用的热启动DNA聚合酶为HotstartAlphaTaqPolymerase，具体制备方法为AlphaTaqPolymerase(VitaNavi，St.LouisUSA)与TaqAntibody(菲鹏公司，深圳)等体积混合，室温放置6小时。在图7和图8中可见，使用热启动酶可以有效减少非特异性扩增。

[0105]实施例6、HotstartAlphaTaqPolymerase的用量对DirectS-Poly⑴Plus方法扩增效率的影响

[0106]本实施例对HotstartAlphaTaqPolymerase的酶量对miRNA的直接扩增效率做了分析。从图9中可以看出，HotstartAlphaTaqPolymerase的活性非常高，20ulPCR体系中0.0125uL的酶量即可满足扩增要求。

[0107]实施例7、HotstartAlphaTaqPolymerase的用量对DirectS-Poly⑴Plus方法中出现的非特异性扩增的影响

[0108]本实施例探索了不同用量HotstartAlphaTaqPolymerase对非特异性扩增的影响，从图10中可以看出，20uLPCR体系加入0.4uLHotstartAlphaTaqPolymerase会造成一定的非特异性扩增；如果酶量降低到〇.0125UL(如图11)，非特异性扩增会得到很好地抑制。

[0109]实施例8、DirectS-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA的线性梯度范围

[0110]本实施例对DirectS-Poly⑴Plus方法检测血浆miRNA的线性梯度范围进行了分析。将血清RNA进行4倍梯度稀释(总RNA使用量对应的初始血浆的用量为0.1-0.0004ul)，然后进行检测。从图12看出，DirectS-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA(hsa-miR_451a，hsa-miR-21_5p,hsa-miR-126_3p,

[0111]hsa-miR-92a_3p，hsa-miR-210_3p，hsa-miR-27b_3p，hsa-miR-103a_3p和hsa-miR-92a-3p)都具有较好的线性相关系数R2

[0112](0.9139-0.9988)。因此，DirectS-Poly⑴Plus方法检测血浆miRNA具有良好的线性关系和较宽的动态范围。

[0113]实施例9、DirectS-Poly⑴Plus方法与其他方法比较

[0114]在本实施例中DirectS-Poly⑴Plus方法将与最为流行的Stem-loop方法和对比例1中的S-Poly(T)Plus方法做比较。其中Stem-loop和S-Poly(T)Plus的方法是以纯化的RNA做模板。S-Poly(T)Plus方法同实施例I，Stem-loop方法操作方法则按照试剂盒TaqManmicroRNAassaykit(AppliedBiosystems)说明书。

[0115]本实施例中，共用三种miRNA检测方法检测六个miRNA，SPhsa-miR-140-5p，hsa-miR-124a_3p，hsa-miR-16_5p，hsa-miR-93_5p，hsa-miR-25_3p和hsa-miR-106_5p。如图13所示，除去hsa-miR-16-5p(25·43)和hsa-miR-93-5p(27·78)的Ct值在S-Poly(T)Plus方法中略小，其余的miRNACt值均在DirectS-Poly⑴Plus方法中最小。DirectS-Poly(T)Plus方法比stem-loop方法灵敏度高出7-342倍(2·8-8·4个Ct值）。

[0116]实施例10、DirectS-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0117]在本实施例中，用DirectS-Poly⑴Plus方法做了六个miRNA的单样本验证，内参hsa-miR-93-5p为归一化标准，使用血浆样本来自于30个健康志愿者和30个结直肠癌病人。从图14可以看出，hsa-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p和hsa_miR-451a在单个样本验证中表达量显著上调，hsa-miR-30b_5p表达量显著下调，hsa-miR148a_3p表达量没有显著变化。

[0118]对比例2、S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0119]在本实施例中，为了验证DirectS-Poly(T)Plus方法得出的结论，再次使用3_Poly(T)Plus进行六个miRNA的单样本验证，外参cel-miR-54为归一化标准，使用血衆样本同实施例10。从图15可以看出，六个miRNA的表达趋势与DirectS-Poly⑴Plus方法得到的结果一致。因此，我们可以得出结论，DirectS-Poly⑴Plus方法是稳定可靠的，并且1183-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p，hsa_miR-451a和hsa-miR-30b_5p可以作为结直肠癌潜在的生物标记物。

[0120]本发明以S-Poly⑴Plus技术为基础，介绍一种灵敏但无需进行RNA提取的miRNA检测方法，即miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术(DirectS-Poly(T)Plus，简称DSPP)。在DirectS-Poly⑴Plus方法中，miRNA首先要从蛋白复合物中释放出来，得到粗提的RNA;然后基于S-Poly⑴Plus方法，粗提RNA在同一反应体系中同时加尾和逆转录。忽略操作时间，用本发明中的DirectS-Poly⑴Plus方法，cDNA可以在95分钟内制备完成，加上qPCR时间，140分钟可以完成整个miRNA检测流程。从48个样品中检测1个miRNA，仅需3个小时即可完成整个操作过程，而提取核酸的方法至少需要一天时间。此项DirectS-Poly⑴Plus技术，将会极大地简化检测流程、降低成本，更有力的推动循环miRNA肿瘤标志物早日进入临床应用。

[0121]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

 VitaNaviTechnolog是华盛顿大学BarnesWayne教授创办的一家专门从事Taq酶及其相关产品研发与销售的生物公司。BarnesWayne教授是国际上著名的Taq酶专家，也是长片段基因PCR扩增技术的发明人和专利所有人（1993，PNAS；U.S.Patent5,436,149）。20多年来，BarnesWayne教授始终致力于PCR聚合酶，研发了系列TaqDNA聚合酶产品，远销全球40多个国家，是目前国际上生产PCR聚合酶的主要供应商之一。美国VitaNaviTechnology公司研发的新型高耐受性DNA聚合酶为基因检测技术带来了根本性的革新，彻底解决了依赖于纯化的核酸DNA为模板进行PCR扩增这一瓶颈问题。

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