企业QQ
官方微信
蚂蚁淘(ebiomall）作为一家生命科学领域的垂直电商平台，公司专注生物医学科研用品的全球导购和品牌推广，为海内外厂方与代理经销商搭建跨境贸易系统和交流平台。产品齐全，200+分类，1000+品牌，500万+产品信息。100%正品，专业售后，到货快，在线下单，简单轻松，节省科学家宝贵的科研时间。为您竭诚服务！
【订购】蚂蚁淘生物科技 联系方式：4000-520-616
更多产品，更多优惠！请联系我们！
苏州蚂蚁淘生物科技有限公司
免费热线：4000-520-616
官网：https://www.ebiomall.cn/
鸽肉含有多种氨基酸、维生素及微量元素；鸽蛋也是养生、滋补的佳品。随着国内外鸽子市场消费水平的增长，越来越多的商家投入到鸽子生产中，鸽子的繁育和发展受到了更多的关注。鸽子属于单态性鸟类，即雌雄性别在外观上表现一致。鸽子还是典型的“一夫一妻”制的繁殖方式，如果性别比例不当，不仅会使鸽群不安定，还会影响繁殖，降低产蛋率，所以雌雄鉴别在鸽子养殖业中具有重要作用。
鸽子作为晚成鸟，雏鸽体型小且雌雄外貌形态差别甚微，不像一般家禽可以从外形上区分雌雄。因此，人们对鸽子的雌雄鉴定主要依赖分子生物学方法，而其中CHD-W基因鉴定法最为常用。CHD1(chromo-helicase-DNAbindingprotein-1)在非平胸鸟类的Z、W染色体都有分布，两者的外显子序列和大小相似，内含子大小却有很大差别。国内外学者根据这个特性，利用内含子两侧保守序列设计特异性引物，使用PCR方法对CHD-W进行扩增，用于多种非平胸目鸟的性别鉴定，并取得了显著进展。
然而，一方面现有的引物主要针对普遍的非平胸目鸟类，与特定鸟类的基因吻合度低，PCR效果较差；另一方面现有的引物扩增雌性两条带大小差别不大，不易区分，容易造成判断失误；而且，在鸽子基因组DNA的提取过程费时费力，还容易造成样品污染，影响检测结果。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种技术实用性强、重复性好、效率高的直接对血液扩增鉴定鸽子性别的方法。该方法既可节约鸽子基因组DNA提取的成本，降低样本污染的风险和假阳性的概率，又可以用于鉴别外观上难以区分性别的鸽子的性别鉴定。
本发明的目的之一是提供一种鉴定鸽子性别的引物对。该引物对为：
上游引物CHd-WL1(SEQIDNO：1，5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’)；
下游引物CHd-WR1(SEQIDNO：2，5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。
本发明的目的之二是提供一种鉴定鸽子性别的PCR试剂盒。该试剂盒包括：所述引物对SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、LAPCRbuffer、dNTPs、PEC-1和OmniKlentaq。
最后，本发明的目的提供一种鉴定鸽子性别的方法。具体步骤如下：对NCBI数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定较为保守的区域，设计一对原创性引物对，引物对名称为CHd-WL1(核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。采集鸽子翅静脉的新鲜血液或者抗凝管(EDTA)收集的冻存血，利用该引物对进行PCR扩增，PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳后扩增产物为单一条带，可以判定该个体为雌性；电泳后扩增产物无条带，可以判定该个体为雄性。
与现有技术相比，本发明直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率；在保守区域设计引物用于鸽子性别的鉴定，PCR扩增效果好，电泳检测条带清晰，结果易读，可以准确地判定鸽子性别；本发明设计引物通用性强，适用于鸽子品种包括但不限于白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽等。本发明使用血液直扩鉴定鸽子性别，是一种技术实用性强、重复性好、效率高的的方法。
附图说明
图1实施例中鸽子血液直接PCR产物电泳后的图谱；其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为Marker，♀为雌性，♂为雄性。
具体实施方式
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例
1、鸽子血液采集
本发明的样品来源于鸽子5个品种：白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽，每个品种雌雄各4只。先将鸽子侧卧保定，露出腋窝处，拔去该部羽毛，可见翼下静脉，压迫翼下静脉的近心端，使血管怒张，消毒后，手持采血针由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入，采完后要压迫止血。采集的血液可直接检测或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷冻保存。
2、引物设计
对NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对，确定保守的区域，利用primer5.0设计一对原创性引物对：CHd-WL1(核苷酸序列SEQIDNO：1CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQIDNO：2ATATCTTACCGCCTGATCTC)，该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于鸽子性别的分子鉴定。
3、PCR扩增
20μl反应体系中加入鸽子血液0.8μl、LAPCRbuffer2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs1μl、PEC-15μl、OmniKlentaq0.3μl、ddH2O9.7μl。其中：LAPCRbuffer来自宝生物工程(大连)有限公司的10×LATaqBufferII(Mg2+plus)(CodeNo.9153A)，dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司(CodeNo.4030Q)，PEC-1增强剂购于VitaNaviTrchnology(VN260P)，OmniKlentaq直扩酶来自美国Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F)，ddH2O为高压灭菌的去离子水，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，工作浓度为10μM。表1是PCR的反应体系。
PCR反应条件为：98℃5min，35个循环：95℃30s，54℃30s，72℃45s，后72℃延伸5min，反应产物于4℃保存。
表1
4、性别鉴定
将PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。鸽子性别鉴定检测结果如图1所示：其中电泳图谱第一行：白卡1-8为白卡鸽，深王1-8为深王鸽，白王1-8为白王鸽；电泳图谱第二行：银王1-8号为银王鸽，泰森1-8为泰森鸽，B为空白对照。图中M为marker，是天根生化科技(北京)有限公司的100bpDNAladder，♀为雌性，♂为雄性。从扩增产物电泳图谱可知：扩增产物电泳为单一条带的是雌鸽，长度约370bp；扩增产物电泳无条带的是雄鸽。
5、序列分析
由于雄性鸽子不能扩增出目的条带，因此我们将经过鉴定的雌鸽样本的PCR扩增产物送华大基因测序，以验证性别鉴定的准确性。雌鸽样本的PCR扩增产物测序峰图使用Chromas软件查看，测序碱基序列结果使用DNAMAN软件查看，并使用DNAMAN软件将鸽子的测序碱基序列和NCBI数据库公布的多种鸟类的CHD1序列进行对比分析，结果显示扩增序列与参考序列有很高的一致性，说明我们扩增的序列为CHD1基因，进而说明我们设计的引物性别鉴定的结果是真实可靠的。
本发明方法技术实用性强，重复性好，效率高。直接使用鸽子血液进行PCR检测，不仅节省了成本和劳动时间，还降低了样本污染的风险和假阳性的概率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法。
背景技术
[0002]MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA通过与祀mRNA的3’端非翻译区（3’-UTR)结合，降解祀mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。
[0003]长期以来，基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有poly(A)加尾法（ShiR，Biotechnique·2005，39(4):519-525)和茎环引物（Stemloop)法（ChenC，NucleicAcidsRes.2005,33(20):1-9)。Poly⑷加尾法是利用poly⑷聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly⑷尾巴，然后用含有Olig0(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly㈧加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。
[0004]KangK等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly⑴法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang，K，PloSone.2012.7，e48536.)中进行了公开。在S-Poly⑴方法中，所用引物从5’端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly㈧加尾法和茎环引物法相比，S-Poly(T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升级版的S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号:201510558101.5)，miRNA的Poly㈧加尾和逆转录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly⑴Plus技术又有进一步改进和提高，其总体灵敏度比S-Poly(T)方法提高2-8倍。
[0005]现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。
[0006]可见，现有技术还有待完善。
发明内容
[0007]鉴于此，有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸，更为简便、灵敏、高效、廉价的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，称之为DirectS-Poly(T)Plus(DSPP)。
[0008]为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：
[0009]一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，所述方法不需提纯核酸，将miRNA从蛋白复合体中裂解出来，直接进行RT-qPCR检测。
[0010]进一步的，所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，包含以下步骤：
[0011]S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中的蛋白复合体中释放出来;将所得的混合物离心，得上清即为粗提RNA，40u1的混合物可以吸取约35ul上清；
[0012]S2、加尾逆转录:将所述步骤Sl中所获得粗提RNA进行加Poly(A)尾及S-Poly⑴特异性逆转录；
[0013]S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定量检测。
[0014]进一步的，所述步骤Sl中所述样本用量为20〜50ul。
[0015]进一步的，所述步骤Sl中裂解用试剂包括组分:20ul2Xlysisbuffer、lul蛋白酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。
[0016]进一步的，所述2Xlysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pHS8.0。
[0017]进一步的，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。
[0018]进一步的，所述裂解条件为50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。
[0019]进一步的，所述步骤Sl中的离心条件为：10,000〜14,000g，4°C条件下离心5〜15分钟;优选13，OOOg，4°C条件下离心5分钟。
[0020]进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyApolymerase)和逆车专录酉每（reversetranscriptase)〇
[0021]进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分比为5〜75%，优选40%。
[0022]进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含:0.5-7.5uL上清模板、1±0.2yL的0.5ymol/LRTprimer、l±0.2U的PolyAPolymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的reactionbuffer、RNase_freeWater补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37〜42°C保温50〜70min，74〜76°C保温3〜7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。
[0023]进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：4uL上清模板，IyL的0.5μΜRTprimer，IU的PoIyAPolymerase，100U的MMLV，1·5yL的reactionbuffer，RNase-freeWater补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。
[0024]进一步的，所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-timePCR定量检测，此过程使用的DNA聚合酶为热启动酶，目的是减少非特异性扩增;real-timePCR反应体系为:4XqPCRreactionBuffer:5yL、lymol/LForwardPrimer4yL、10ymol/LuniversalreverseprimerO.10ymol/LuniversalTaqmanprobe0.5yL、100XROXRerferenceDyeO.2μL、hotstartAlphaTaqPolymeraseO.0125yL、cDNA0.5yL、RNase_freeWater加至20yL;反应条件为:预变性95°C5分钟，变性95°CIOs，退火60°C40s，40个循环。
[0025]进一步的，所述热启动酶的制备方法为:将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合，室温放置6小时。
[0026]进一步的，所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清;优选样本为血浆。
[0027]本发明有益效果：
[0028]1、本发明DirectS-Poly(T)Plus方法中，不需要提取核酸的步骤，定量检测miRNA，其流程图如图1所示。操作简便，缩短时间，制备cDNA的时间至少减少70%以上，简便性优于传统方法。
[0029]2、本发明DirectS-Poly⑴Plus方法在逆转录这一步对于模板量要求范围更宽，5%-75%的粗提RNA均可满足逆转录要求，转录效率优于传统方法。
[0030]3、本发明中的技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面，20ul的体液样本就可以实现175个miRNA的检测。
[0031]4、本发明DirectS-Poly(T)Plus方法能从包括血清、血浆/血清、尿液、乳汁、唾液、痰液、粪便抽提上清及细胞培养液等生物体液样本中高效检测miRNA，检测效率比传统方法高出一个数量级，从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。
[0032]5、本发明的简便性、灵敏性和特异性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面有重要应用前景，可广泛用于肿瘤、心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。
附图说明
[0033]图1为miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测流程(DirectS-Poly⑴Plus)。其中，在加尾逆转录体系中，4u1粗提RNA作为模板为最优方案。
[0034]图2为DirectS-Poly⑴Plus方法中不同裂解方案的效果比较。
[0035]图3为DirectS-Poly(T)Plus方法中一步法(加尾和逆转录反应一步完成)和两步法(先加尾后进行逆转录反应)的差别。
[0036]图4为DirectS-Poly⑴Plus方法中起始粗提RNA加入比例。
[0037]图5用DirectS-Poly(T)Plus比较同一志愿者的血清血浆中miRNA表达量。***P〈0·001〇
[0038]图6以提取的RNA为模板，用S-Poly(T)Plus方法比较同一志愿者血清和血浆中miRNA的表达量。用miR-cel-54做归一化内参，*#P〈0.001。
[0039]图7为热启动AlphaTaqPolymerase对DirectS-Poly⑴Plus方法中非特异性扩增减少作用。
[0040]图8为hsa-miR-15b_5p扩增曲线，-RT:不加逆转录酶的阴性对照，检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。
[0041]图9为热启动Alphataqpolymerase用量对miRNA检测Ct值的影响（20ul体系），检测方法为DirectS-Poly(T)Plus。
[0042]图10为使用0.4ulHotstartAlphaTaqPolymerasemiRNA的阴性对照（不加逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。
[0043]图11为使用0.0125ulHotstartAlphataqPolymerasemiRNA的阴性对照（不加逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。
[0044]图12为DirectS-Poly⑴Plus方法的灵敏度和线性范围。
[0045]图13为三种miRNA检测方法灵敏度比较。
[0046]图14为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为DirectS-Poly⑴Plus。数据为土SE，**P〈0·01，***P〈0·001，ns，不显著。
[0047]图15为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为S-Poly⑴Plus(内参为miR-cel-54)。数据为土SE，**P〈0·01，***P〈0·001，ns，不显著。
具体实施方式
[0048]为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
[0049]如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售，所采用的方法均为常规方法，其中引物、探针来自美国IntegratedDNATechnologies(IDT)公司。
[0050]本申请中主要材料来源如下：
[0051]血液来源于深圳市人民医院和北京大学深圳医院。血浆收集流程为:采血于含有EDTA抗凝剂的采血管，4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血浆;全血样本室温放置1小时，取血清4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血清。血清/血浆样本分装为20-50ul的体系，保存于-80°C。
[0052]miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测方法(DirectS-Poly(T)Plus)最优方案流程如图1。在最优的方案中，20ul的血浆可以制备35ul粗提RNA，对应87.5ulcDNA。按照20ulqPCR体系加入0.5ulcDNA，平均可以检测175个miRNA。忽略操作时间，整个miRNA检测流程只需140分钟。
[0053]实施例IDirectS-Poly⑴Plus方法比较血浆和血清中的循环miRNA含量
[0054]在本实施例中，同一志愿者血清和血浆同时作为模板，共收集了同一健康志愿者的血清和血浆样本10对。用本发明中DirectS-Poly(T)Plus方法分别检测等量血清或者血浆样本中的miRNA表达量。具体包含以下步骤：
[0055]Sl、裂解离心，具体步骤为：
[0056]I)20uL血楽_/血清与20uL2Xlysisbuffer混合均勾，加入IuL蛋白酶K，50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟，置于冰上；
[0057]2)13,00(^，4°(：离心5分钟；吸取上清液(粗提1?熟)转移至另一新的离心管中或直接用于S2;
[0058]S2、加尾逆转录:miRNA加Poly(A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。
[0059]所述2Xlysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pH为8·0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。
[0060]加尾逆转录的反应体系包含：4uL粗提RNA，lyL的0.05μΜRTprimer(逆转录引物），IU的PolyAPolymerase(多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV(鼠白血病逆转录_，1·5yL的reactionbuffer(反应缓冲液），RNase_freeWater(无RNA酶水）补足至10yL。所述reactionbuffer包含以下终浓度的组分：200mMTris_HCl，600mMNaCl，40mMMgCl2,4mMATP，2mMdNTP，pH8.0。加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。
[0061]所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14-20个碱基的PCR通用引物序列、14-20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5-7个与miRNA3’配对的特异性碱基。更优选地，所述S-Poly⑴引物序列从5’端到3’端依次为：16个碱基的PCR通用引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和6个与miRNA3’配对的特异性碱基。[0062]本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase，根据各自序列设计不同的S-Poly⑴引物、上游引物，检测不同miRNA的S-Poly⑴引物序列如表1所示。
[0063]表1、本发明中所使用的引物和探针
[0066]S3、PCR:以步骤S2中逆转录获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-timePCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3-8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly⑴引物的14-20个碱基的通用引物序列。
苏州蚂蚁淘生物科技有限公司专注于为科研工作者提供CST，Abcam，Sigma，biorbyt，Abclonal，AbDSerotec，GeneTex，ENZO，ScienCell，BI，Swant，emfret，Biovision，Roche，Millipore，BD，Life，eBioscience，Thermo，Qiagen，Santa，Peprotech，R&D，ImmunoStar，GenStar，GeneCopoeia，Cusabio，Bioss，NeoBioscience