重要要推广的品牌Nanocs，  chromotek，   polysciences，  echelon-inc ， Bio-Rad，伯乐 ，     R&D Systems，  Millipore，密理博 ， Jackson，   NEB，New England Biolabs ，Sigma-Aldrich，西格玛奥德里奇，  Athens Research & Technology，  Illumina ， Tocris ， TwistDx， Enzymatics ，酶科技，Novus，Thermo，thermofisher，赛默飞，赛默飞世尔，gibco、invitrogen，英潍捷基，ambion、ebioscience、molecular probes、ABI，Applied Biosystems、Thermo Scientific，pierce。

专利基本信息

申请号	CN201710442989.5	申请日	2017-06-13
公开（公告）号	CN107385014A	公开（公告）日	2017-11-24
申请公布号	CN107385014A	申请公布日	2017-11-24
分类号	C12Q1/68(2006.01)I	分类	生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程
发明人	苟德明;牛燕琴;康康	申请（专利权）人	深圳大学
代理机构	广州番禺容大专利代理事务所（普通合伙）	代理人	刘新年
地址	518060 广东省深圳市南山区南海大道3688号粤海门广场A207
摘要	本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接检测血清或血浆中循环microRNA(miRNA)的实时荧光定量RT‑qPCR方法。所述方法包括：S1：裂解血清或血浆中的外泌体及miRNA蛋白复合体，离心后得到循环miRNA粗提物；S2：miRNA加尾及逆转录；S3：RT‑qPCR定量检测。本发明miRNA直接荧光定量RT‑qPCR扩增方法[Direct S‑Poly(T)Plus,简称DSPP]中，不需要提取核酸，且miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，可在95分钟内完成cDNA的制备。该技术体系灵敏度与stem‑loop方法相比提高数十甚至上百倍，建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的miRNA检测的技术体系。该技术体系尤其适合于临床应用推广及其从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

一、Klentaq1 / Klentaq LA?

实例1：用Kelntaq LA扩增大于20kb的大片段基因。
?

?

二、高耐受性(Inhibitor-Resistant) 聚合酶：OmniTaq / Omni Klentaq
产品特征：
1. 对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性，可直接对样品进行PCR检测，无需进行DNA分离纯化。
2. 可以耐受高达40% 的全血，20% 的血浆或血清，已应用于多种遗传病的分子诊断和临床检验。
3. 可用于法医、环境监测、农业、动植物检疫和临床诊断等领域。
4. 可以从人血液中一步扩增疟疾基因。
5. 与PCR增强剂结合使用时，其耐受性将进一步提高。
6. 使用Omni 酶不仅节省时间、降低成本，而且实现了从微量样品中的扩增，避免因提取过程所致的DNA丢失或污染。

实例 2：用OmniTaq（OT） 和 Omni Klentaq（OKT）从肝素抗凝血液中一步扩增乙肝病毒基因。
?

实例 3：用新突变的Omni酶从富含腐殖酸的人基因组中扩增1.1kb的CCR5基因。
?

实例 4：用新突变的Omni酶从巧克力和黑胡椒中直接扩增基因。

?
三、热启动聚合酶(Hot-start) 聚合酶：Cesium Taq / Cesium Klentaq
产品特征：
1. Cesium Taq 和Cesium Klentaq是一种冷敏感的突变体，在室温条件下聚合酶的活性很低，当升高温度进入PCR循环时聚合酶的活性就全部释放出来，因而具有内置式热启动功能。
2. 与现有化学修饰或抗体封阻的热启动聚合酶相比，Cesium Taq 和Cesium Klentaq的聚合酶活性更高，扩增效果更好。
3. Cesium Klentaq具有热启动和高耐受性双重效果。

实例 5：用Cesium Klentaq扩增基因热启动效果比较

?
四、PCR增强剂（PCR enhancing cocktails, PEC）
产品特征：
1. 联合使用PEC-1 或 PEC-2与高耐受性Taq酶（OmniTaq and Omni Klentaq）可以更好的克服样品中各种物质对PCR反应的抑制作用，进一步提高PCR扩增效率，简化PCR操作流程提高。
2. PEC有助于从基因组中扩增GC含量高达80%的基因。
3. PEC也可用于qPCR（SYBR和Taqman probe）。
4. 新研发的PCR增强剂PEC-3 and PEC-4有助于从食品中扩增基因。

?

实例 6：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从不同类型的牛奶中检测沙门氏杆菌 Inv 基因。
?

?

实例 7：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从人的基因组DNA或全血中直接扩增3个高GC含量的基因。
?

五、各种特异性一步PCR试剂盒
VitaNavi Tech公司开发了系列一步法PCR和qPCR试剂盒，可以直接从样品中扩增目的基因。

1. Direct Blood PCR Kit： 从血液中直接扩增目的基因

实例 8：使用Direct Blood PCR Kit从全血中一步扩增CCR5基因

[0069] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为:预变性95°C5分 钟，变性95°C10s，退火60°C40s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差） 表不。

[0070] 结果表明，血清和血浆样本都可用于miRNA直接定量RT-qPCR检测，但是血浆中 miRNA检测Ct值全部显著低于血清，说明miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图5)。

[0071] 对比例l、S-Poly⑴Plus方法检测循环miRNA

[0072] S-Poly⑴Plus法检测循环miRNA需要提取核酸，包括以下步骤：

[0073] (一）、提取血清/血浆总RNA

[0074] 在本实施例中提取血清/血浆总RNA，具体步骤为：

[0075] 1)0. IpM线虫miRNA cel-miR-54作为内参提前加入ImL的RNAiso-Plus (TaKaRa) 中，加入IOOyL血清/血浆，吹打混匀，室温静置5分钟；加入200yL氯仿，盖紧离心、管盖，剧烈 振荡20秒;室温静置5分钟；

[0076] 2) 12,000g，4°C离心15分钟；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的上 清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相;吸取500yL上清液转移至另一 新的1.5mL离心管中；

[0077] 3)向上清液中加入5yL适当浓度的糖原(Applichem)溶液，使糖原终浓度为15yg/ mL，再加入与等体积的异丙醇(505μ〇，上下颠倒充分混匀，-20 °C或-80 °C静置至少10分钟；

[0078] 4) 13，500g，4°C离心10分钟；弃去上清液，向沉淀中加入ImL的75 %乙醇，轻轻颠倒 清洗沉淀；13，500g，4°C离心5分钟，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并 弃尽上清；

[0079] 5)沉淀室温干燥2〜3分钟，加入IOOyL RNase-free Water溶解，溶解产物置于-80 °C储存，或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。

[0080] (二）、S-Poly ⑴ Plus法检测miRNA

[0081] S-Poly⑴Plus法检测miRNA，使用逆转录引物和qPCR引物同实施例1表1，包括以 下步骤：

[0082] Sl、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体 系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0083] 加尾逆转录的反应体系包含：4yL血清总RNA，lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物），IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV (鼠白血病逆转录_，2.5yL 的reaction buffer (反应缓冲液），RNase_free Water (无RNA酶水）补足至10yL。所述 reaction buffer包含200mM Tris-HCl，600mM NaCl，40mM MgC12,4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为:37°(：保温3〇1^11，42°(：保温3〇1^11，75°(：保温51^11以灭活酶， 然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0084] S2、以步骤Sl中逆转录获得的第一链cDNA为模板，Real-time PCR定量检测采用探 针法，所用探针为通用探针，其序列同实施例UReal-time PCR的反应体系如下：

[0086] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为:预变性95°C3分 钟，变性95 °C IOs，退火60 °C 30 s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。本实施例中相对表达量 用2_~ ACt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差)表示。

[0087] 结果表明，血清和血浆样本都可用于S-Poly (T) Plus法检测miRNA的模板，但是血 浆中miRNA相对表达量显著高于血清，再次验证miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图 6) ο

[0088] 实施例2本发明的Direct S-Poly⑴Plus (DSPP)方法中不同裂解方案的效果比 较

[0089] 在Direct S-Poly (T) Plus方法中，可选用以下六种处理方式中的任一种实现 miRNA从蛋白复合体中裂解出来：

[0090] ①裂解体系：20ul裂解液、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟；

[0091] ②裂解体系：20ul RNase-free water、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处 理20分钟，然后95 °C保持5分钟；

[0092] ③裂解体系：20ul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条件：50°C处理20分钟，然 后95 °C保持5分钟；

[0093] ④裂解体系：20ul 2Xlysis buffer、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟；

[0094] ⑤裂解体系：20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处 理20分钟，然后95 °C保持5分钟；

[0095] ⑥裂解体系：IOul 2 X lysis buffer、IOul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条 件:50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。

[0096] 上述处理方式中所述的裂解液包括以下终浓度的组分：2.5%的tween-20，50mM Tris和ImM EDTA;所述2 X lysis buff er包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、 300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2;pH为8.0;所述蛋白酶K的终浓度为 15U/mL。

[0097] 其他操作同实施例1。

[0098] 实验结果显示，在上述方案中，单独使用tween 20 (裂解液的主要功能成分，详见 参考文献Zhang Q，0ncotarget，2016,7 (16) :21865-21874)、蛋白酶K或者二者同时使用的 效果都差强人意（分别对应方案①，②，③）。在方案⑤中，使用2X lysis buffer和蛋白酶K 的组合，miRNA的Ct值最小，与方案③相比，降低了0.8〜6.8。方案⑤和⑥对比实验，表明可 能tween 20在裂解miRNA包裹蛋白复合物的同时，也能对poly (A) /RT反应造成不利影响（图 2)。因此，方案⑤在本发明中被推荐为最优方案，裂解反应血浆用量为20〜50ul。

[0099] 实施例3 Direct S-Poly⑴Plus方法中一步法和两步法灵敏度对比

[0100] 在之前的发明S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号：201510558101.5)，以纯化的 RNA为模板，一步法灵敏度比两步法大大提高。两步法即miRNA Poly㈧加尾完成后再进行 逆转录;一步法即miRNA的Poly㈧加尾和逆转录在同一反应中进行。在本次发明中，以粗提 RNA为模板，操作同实施例1，两步法与一步法的灵敏度再次比较。如图3所示，在Direct S-Poly (T) Plus方法中，本发明方案使一步法的灵敏度比其两步法提高了2.5〜52倍（1.7〜 5.7个Ct值差距）（图3)。

[0101] 实施例4 miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术体系起始粗提RNA加入比例效果对比

[0102] 粗提RNA可能含有一些抑制Poly (A)加尾和逆转录酶活性的成分，因此在Direct S-Poly⑴Plus方法中粗提RNA加入的起始量对方法灵敏度的存在一定影响，采用不同的粗 提RNA起始量，试验操作同实施例1，试验结果如图4,可以看出，当粗提RNA的起始量体积百 分数从0.5%增长至40%时，miRNA的Ct值线性降低。但是当粗提RNA加入的比例升高至60% 和75%时，miRNA的Ct值出现了回复升高。在本发明中，40%的粗提RNA起始量被推荐为最佳 比例。

[0103] 实施例5、热启动DNA聚合酶在Direct S-Poly⑴Plus方法中的作用测试

[0104] 在Direct S-Poly (T) Plus方法体系中，没有RNA的纯化，可能会引入一些基因组 DNA的污染，因此在qPCR中，更容易出现与基因组DNA的错配。减少非特异性扩增的一个有效 方法是热启动，即在热循环开始之前防止或者减少DNA的合成。本实施例对Direct S-Poly ⑴Plus方法中PCR部分所用的普通DNA聚合酶和热启动DNA聚合酶做了对比分析。本实施例 中采取了一种有效的形成热启动的方法，即Taq酶抗体，抗体与DNA聚合酶结合，在热循环开 始之前，酶活不会被启动。本实施例中采用的热启动DNA聚合酶为Hotstart Alpha Taq Polymerase，具体制备方法为 Alpha Taq Polymerase (VitaNavi，St .Louis USA)与 Taq Antibody (菲鹏公司，深圳)等体积混合，室温放置6小时。在图7和图8中可见，使用热启动酶 可以有效减少非特异性扩增。

[0105] 实施例6、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 扩增效率的影响

[0106] 本实施例对Hotstart Alpha Taq Polymerase的酶量对miRNA的直接扩增效率做 了分析。从图9中可以看出，Hotstart Alpha Taq Polymerase的活性非常高，20ulPCR体系 中0.0125uL的酶量即可满足扩增要求。

[0107] 实施例7、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 中出现的非特异性扩增的影响

[0108] 本实施例探索了不同用量Hotstart Alpha Taq Polymerase对非特异性扩增的影 响，从图10中可以看出，20uLPCR体系加入0.4uL Hotstart Alpha Taq Polymerase会造成 一定的非特异性扩增；如果酶量降低到〇. 0125UL (如图11)，非特异性扩增会得到很好地抑 制。

[0109] 实施例8、Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA的线性梯度范围

[0110] 本实施例对Direct S-Poly⑴Plus方法检测血浆miRNA的线性梯度范围进行了分 析。将血清RNA进行4倍梯度稀释(总RNA使用量对应的初始血浆的用量为0.1-0.0004ul)，然 后进行检测。从图12看出，Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA (hsa-miR_451a，hsa-miR-21_5p,hsa-miR-126_3p,

[0111] hsa-miR-92a_3p，hsa-miR-210_3p，hsa-miR-27b_3p，hsa-miR-103a_3p和hsa-miR-92a-3p)都具有较好的线性相关系数R2

[0112] (0.9139-0.9988)。因此，Direct S-Poly ⑴ Plus方法检测血浆miRNA具有良好的 线性关系和较宽的动态范围。

[0113] 实施例9、Direct S-Poly⑴Plus方法与其他方法比较

[0114] 在本实施例中Direct S-Poly⑴Plus方法将与最为流行的Stem-loop方法和对比 例1中的S-Poly (T) Plus方法做比较。其中Stem-loop和S-Poly (T) Plus的方法是以纯化的 RNA做模板。S-Poly (T) Plus方法同实施例I，Stem-loop方法操作方法则按照试剂盒TaqMan microRNA assay kit (Applied Biosystems)说明书。

[0115] 本实施例中，共用三种miRNA检测方法检测六个miRNA，SPhsa-miR-140-5p，hsa-miR-124a_3p，hsa-miR-16_5p，hsa-miR-93_5p，hsa-miR-25_3p 和 hsa-miR-106_5p。如图 13 所示，除去hsa-miR-16-5p (25 · 43)和hsa-miR-93-5p (27 · 78)的Ct值在S-Poly (T) Plus方法 中略小，其余的miRNA Ct值均在Direct S-Poly⑴Plus方法中最小。Direct S-Poly(T) Plus方法比stem-loop方法灵敏度高出7-342倍(2 · 8-8 · 4个Ct值）。

[0116] 实施例10、Direct S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0117] 在本实施例中，用Direct S-Poly⑴Plus方法做了六个miRNA的单样本验证，内参 hsa-miR-93-5p为归一化标准，使用血浆样本来自于30个健康志愿者和30个结直肠癌病人。 从图 14可以看出，hsa-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p和 hsa_miR-451a 在单 个样本验证中表达量显著上调，hsa-miR-30b_5p表达量显著下调，hsa-miR148a_3p表达量 没有显著变化。

[0118] 对比例2、S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0119] 在本实施例中，为了验证Direct S-Poly (T) Plus方法得出的结论，再次使用3_ Poly (T) Plus进行六个miRNA的单样本验证，外参cel-miR-54为归一化标准，使用血衆样本 同实施例10。从图15可以看出，六个miRNA的表达趋势与Direct S-Poly⑴Plus方法得到的 结果一致。因此，我们可以得出结论，Direct S-Poly⑴Plus方法是稳定可靠的，并且1183-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p，hsa_miR-451a 和 hsa-miR-30b_5p 可以作为 结直肠癌潜在的生物标记物。

[0120] 本发明以S-Poly⑴Plus技术为基础，介绍一种灵敏但无需进行RNA提取的miRNA 检测方法，即miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术(Direct S-Poly (T) Plus，简称DSPP)。在 Direct S-Poly⑴Plus方法中，miRNA首先要从蛋白复合物中释放出来，得到粗提的RNA;然 后基于S-Poly⑴Plus方法，粗提RNA在同一反应体系中同时加尾和逆转录。忽略操作时间， 用本发明中的Direct S-Poly⑴Plus方法，cDNA可以在95分钟内制备完成，加上qPCR时间， 140分钟可以完成整个miRNA检测流程。从48个样品中检测1个miRNA，仅需3个小时即可完成 整个操作过程，而提取核酸的方法至少需要一天时间。此项Direct S-Poly⑴Plus技术，将 会极大地简化检测流程、降低成本，更有力的推动循环miRNA肿瘤标志物早日进入临床应 用。

[0121] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

苏州蚂蚁淘生物科技有限公司SuZhouebiomall BIOLOGicalTechnologyCo.,Ltd.成立于2017年，经过数年的努力已迅速成为集科研和生产为一体的专业化生物工程公司。特别是ELISA研发，代测，技术服务这一产品已使苏州蚂蚁淘成为中国知名公司。公司产品涵盖ELISA研发、细胞培养，各种生化试剂、各种酶类、分子生物学试剂盒、培养基、自产实验室耗材、小型仪器等。此外、苏州蚂蚁淘还代理了美国药典标准品，中检所标准品，sigma,ScienCell,ATCC,wak0,omega，Worthington、MBI、Bioworld、Calendon等国外各类知名公司的产品。苏州蚂蚁淘将进一步加强人才经营、产品经营，不断提升企业的核心竟争力，实现具有高科技产业体系、知识化创业团队的国际化的公司，服务于生命科学领域，迎接世界经济一体化所带来的机遇与挑战。