原创:vitanavitech直扩PCR酶 进口VitaNavi试剂盒，血清清关,为什么这么便宜?

 VitaNavi Technolog 是华盛顿大学Barnes Wayne教授创办的一家专门从事Taq酶及其相关产品研发与销售的生物公司。Barnes Wayne教授是国际上著名的Taq酶专家，也是长片段基因PCR扩增技术的发明人和专利所有人（1993，PNAS；U.S. Patent 5,436,149）。20多年来，Barnes Wayne教授始终致力于PCR聚合酶，研发了系列 Taq DNA聚合酶产品，远销全球40多个国家，是目前国际上生产PCR聚合酶的主要供应商之一。美国VitaNavi Technology 公司研发的新型高耐受性DNA聚合酶为基因检测技术带来了根本性的革新，彻底解决了依赖于纯化的核酸DNA为模板进行PCR扩增这一瓶颈问题。

 产品简介

苏州蚂蚁淘生物科技有限公司成立于2017年，致力于将全球领先的创新产品和前沿技术带入中国，帮助国内科研工作者在第一时间接触世界范围内的技术革命，并分享研发工具的进步带来的技术红利。依托于集团公司深厚的资源和超过400家的国内优质客户群体，生命科学领域的一站式供应链体系，以及高风险生物危险材料进出口平台的优势，蚂蚁淘生物严格筛选国际创新且经过同行验证过的产品和技术，引入中国市场，开发、孵育和推广。公司的未来将立足于实验室大数据整合和电子商务，结合严格的品牌筛选、创新的营销模式、专注的应用支持和坚实服务，帮助实现生命科学产业链的简单和高效。

为满足集团公司优质客户的广泛生物材料使用需求，公司长期以来提供国际小众品牌的代采购增值服务。经过多年的经验积累和客户反馈，已经建立了成熟完善的国际采购业务平台，美东美西两大合作集货点，自有快速审批和进出口通道。现将此服务开放给广大经销商合作伙伴和全国科研工作者，致力于缩短中国与国际一线研发的差距。至今合作品牌多达300个以上，以下为部分合作品牌摘选A:     AB Biosciences 、ABP Biosciences、aldevron、Almac、Altogen Biosystems   americanBIO、Amsbio、ANP Technologies、Antibody Solutions、Arrayit、ARENA CHEMICAL、A.COSTANTINOB：Bel-Art、BGSC、Brooklyn Tool 、Biomatrica、Biopredic、BioControl、BioGenesC：C Technologies、Central Drug House(P) Ltd、ChemScence、CHEMTRADE、CompTech、Coriell Institute、Creative Biolabs、Computype、CraicD：D&M continuous、DiAgam、Diamond Materials、DocuSign、Dravon、Desert KingE：EdgeBio、EMC microcollections、ENVAIR、EXCEL Scientific、EMC microcollectionsF：Faucet Queen、FinaBioG：G&P Biosciences、Globe、GLO GERM、glycosynthH：hellobio、HENKE-SASS WOLF、Higgins Analytical、HJ-BIOANALYTIKI：Ivy Fine Chemicals、Invitek、Inycom Biotech、iQBIOSCIENCESJ：JCRB Cell Bank、K：Kerafast、KOAMTACL：LAB BIO、LC Labs、LigaTrap、Lighthouse data、LP ITALIANA、Lumafluor、LYTIC SOLUTIONSM：Medkoo、Maddak、MIMETAS、MiTeGenN：Neuro Prob、NextGene、nippongenetics、NORTHWEST ANALYTICS、NovaBioAssays、NU-CHEK PREPO：Orbital Biosciences 、OXITENOP：PAR、PyMOL、Pharmaffiliates、Panagene、Pel Freez、PFEnex、Polylc、Proliant BiologicalsR：Riken、RANKIN、RatiolabS：SRL、SPD Scientific、Sanquin、Sbio、Scarab Genomics、Simport、SOVICELL、Starna cellsT：TSC、Tower optical corporation、TwistDx、TEKnova、Transposagen、Tribioscience、TriLinkU：UltivueX：ximbioZ：Zymesci特殊类别细胞：Riken、JCRB Cell Bank、Kerafast、软件：DocuSign、GraphPad、PyMOL、Craic、NextGene、Lighthouse data进口流程（此处以Amsbio为例，实际不同品牌不同产品类型所涉及流程稍有不同）免责申明1.    本公司并非以上各个品牌在中国区代理商，仅提供产品代理采购业务。2.    本公司承诺所采购产品来自品牌厂家，并可提供相关进口证明。3.    本公司保证全程采用官方指定运输条件进行产品运输。4.    本公司对所委托进口产品品质不做任何担保，如遇质量问题，本公司可协助客户与品牌方进行协商处理售后问题。5.    本公司因仅负责产品代购，因此不做任何技术支持，如采购，我们会提供产品相关的网页链接，可自行查看和下载产品相关的所有信息和技术资料。代采服务咨询如您有海外代采需求，请通过如下任意方式联系我们，并告知产品相关信息，我们将会在24小时之内和您联系。邮箱：info@ebiomall.comQQ：1570468124手机：18915418616（微信同号）电话：0512-67156496 或扫描微信联系我们苏州蚂蚁淘生物科技有限公司简介依托于集团公司深厚的资源和超过400家国内优质客户群体，生命科学领域一站式供应链体系，以及高风险生物材料进出口平台的优势，蚂蚁淘生物严格筛选国际创新且经过同行验证过的产品和技术，引入中国市场，开发、孵育和推广。自公司成立以来，与海外一线品牌建立了长期的交流与合作关系，其中包括多家国际著名细胞和菌种保藏中心。仅2019年内，蚂蚁淘生物接受国内制药企业、科研机构、检测机构和大专院校等单位的委托，从近150个品牌引进各类生物试剂，其中不乏包括细胞株 ，慢病毒，人体组织切片，血液制品等特种试剂。公司与北京中关村联合创新（绿通北平台）建立了长期的交流与合作关系，可为国内客户提供进口代理业务，完成一站式前置审批、风险评估、检疫审批、清关查验、物流仓储等工作。本公司特殊物品进口业务，严格遵守国家相关政策和法规流程，致力于为各单位提供更安全、更专业、更便捷的服务。

[0069] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为:预变性95°C5分 钟，变性95°C10s，退火60°C40s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差） 表不。 [0070] 结果表明，血清和血浆样本都可用于miRNA直接定量RT-qPCR检测，但是血浆中 miRNA检测Ct值全部显著低于血清，说明miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图5)。 [0071] 对比例l、S-Poly⑴Plus方法检测循环miRNA [0072] S-Poly⑴Plus法检测循环miRNA需要提取核酸，包括以下步骤： [0073] (一）、提取血清/血浆总RNA [0074] 在本实施例中提取血清/血浆总RNA，具体步骤为： [0075] 1)0. IpM线虫miRNA cel-miR-54作为内参提前加入ImL的RNAiso-Plus (TaKaRa) 中，加入IOOyL血清/血浆，吹打混匀，室温静置5分钟；加入200yL氯仿，盖紧离心、管盖，剧烈 振荡20秒;室温静置5分钟； [0076] 2) 12,000g，4°C离心15分钟；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的上 清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相;吸取500yL上清液转移至另一 新的1.5mL离心管中； [0077] 3)向上清液中加入5yL适当浓度的糖原(Applichem)溶液，使糖原终浓度为15yg/ mL，再加入与等体积的异丙醇(505μ〇，上下颠倒充分混匀，-20 °C或-80 °C静置至少10分钟； [0078] 4) 13，500g，4°C离心10分钟；弃去上清液，向沉淀中加入ImL的75 %乙醇，轻轻颠倒 清洗沉淀；13，500g，4°C离心5分钟，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并 弃尽上清； [0079] 5)沉淀室温干燥2〜3分钟，加入IOOyL RNase-free Water溶解，溶解产物置于-80 °C储存，或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。 [0080] (二）、S-Poly ⑴ Plus法检测miRNA [0081] S-Poly⑴Plus法检测miRNA，使用逆转录引物和qPCR引物同实施例1表1，包括以 下步骤： [0082] Sl、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体 系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。 [0083] 加尾逆转录的反应体系包含：4yL血清总RNA，lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物），IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV (鼠白血病逆转录_，2.5yL 的reaction buffer (反应缓冲液），RNase_free Water (无RNA酶水）补足至10yL。所述 reaction buffer包含200mM Tris-HCl，600mM NaCl，40mM MgC12,4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为:37°(：保温3〇1^11，42°(：保温3〇1^11，75°(：保温51^11以灭活酶， 然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。 [0084] S2、以步骤Sl中逆转录获得的第一链cDNA为模板，Real-time PCR定量检测采用探 针法，所用探针为通用探针，其序列同实施例UReal-time PCR的反应体系如下： [0086] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为:预变性95°C3分 钟，变性95 °C IOs，退火60 °C 30 s，40个循环。每个PCR反应两个复孔。本实施例中相对表达量 用2_~ ACt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差)表示。 [0087] 结果表明，血清和血浆样本都可用于S-Poly (T) Plus法检测miRNA的模板，但是血 浆中miRNA相对表达量显著高于血清，再次验证miRNA在血浆中的表达量显著高于血清（图 6) ο [0088] 实施例2本发明的Direct S-Poly⑴Plus (DSPP)方法中不同裂解方案的效果比 较 [0089] 在Direct S-Poly (T) Plus方法中，可选用以下六种处理方式中的任一种实现 miRNA从蛋白复合体中裂解出来： [0090] ①裂解体系：20ul裂解液、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟； [0091] ②裂解体系：20ul RNase-free water、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处 理20分钟，然后95 °C保持5分钟； [0092] ③裂解体系：20ul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条件：50°C处理20分钟，然 后95 °C保持5分钟； [0093] ④裂解体系：20ul 2Xlysis buffer、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟； [0094] ⑤裂解体系：20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白酶K、20ul样本，；裂解条件：50°C处 理20分钟，然后95 °C保持5分钟； [0095] ⑥裂解体系：IOul 2 X lysis buffer、IOul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条 件:50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。 [0096] 上述处理方式中所述的裂解液包括以下终浓度的组分：2.5%的tween-20，50mM Tris和ImM EDTA;所述2 X lysis buff er包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、 300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2;pH为8.0;所述蛋白酶K的终浓度为 15U/mL。 [0097] 其他操作同实施例1。 [0098] 实验结果显示，在上述方案中，单独使用tween 20 (裂解液的主要功能成分，详见 参考文献Zhang Q，0ncotarget，2016,7 (16) :21865-21874)、蛋白酶K或者二者同时使用的 效果都差强人意（分别对应方案①，②，③）。在方案⑤中，使用2X lysis buffer和蛋白酶K 的组合，miRNA的Ct值最小，与方案③相比，降低了0.8〜6.8。方案⑤和⑥对比实验，表明可 能tween 20在裂解miRNA包裹蛋白复合物的同时，也能对poly (A) /RT反应造成不利影响（图 2)。因此，方案⑤在本发明中被推荐为最优方案，裂解反应血浆用量为20〜50ul。 [0099] 实施例3 Direct S-Poly⑴Plus方法中一步法和两步法灵敏度对比 [0100] 在之前的发明S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号：201510558101.5)，以纯化的 RNA为模板，一步法灵敏度比两步法大大提高。两步法即miRNA Poly㈧加尾完成后再进行 逆转录;一步法即miRNA的Poly㈧加尾和逆转录在同一反应中进行。在本次发明中，以粗提 RNA为模板，操作同实施例1，两步法与一步法的灵敏度再次比较。如图3所示，在Direct S-Poly (T) Plus方法中，本发明方案使一步法的灵敏度比其两步法提高了2.5〜52倍（1.7〜 5.7个Ct值差距）（图3)。 [0101] 实施例4 miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术体系起始粗提RNA加入比例效果对比 [0102] 粗提RNA可能含有一些抑制Poly (A)加尾和逆转录酶活性的成分，因此在Direct S-Poly⑴Plus方法中粗提RNA加入的起始量对方法灵敏度的存在一定影响，采用不同的粗 提RNA起始量，试验操作同实施例1，试验结果如图4,可以看出，当粗提RNA的起始量体积百 分数从0.5%增长至40%时，miRNA的Ct值线性降低。但是当粗提RNA加入的比例升高至60% 和75%时，miRNA的Ct值出现了回复升高。在本发明中，40%的粗提RNA起始量被推荐为最佳 比例。 [0103] 实施例5、热启动DNA聚合酶在Direct S-Poly⑴Plus方法中的作用测试 [0104] 在Direct S-Poly (T) Plus方法体系中，没有RNA的纯化，可能会引入一些基因组 DNA的污染，因此在qPCR中，更容易出现与基因组DNA的错配。减少非特异性扩增的一个有效 方法是热启动，即在热循环开始之前防止或者减少DNA的合成。本实施例对Direct S-Poly ⑴Plus方法中PCR部分所用的普通DNA聚合酶和热启动DNA聚合酶做了对比分析。本实施例 中采取了一种有效的形成热启动的方法，即Taq酶抗体，抗体与DNA聚合酶结合，在热循环开 始之前，酶活不会被启动。本实施例中采用的热启动DNA聚合酶为Hotstart Alpha Taq Polymerase，具体制备方法为 Alpha Taq Polymerase (VitaNavi，St .Louis USA)与 Taq Antibody (菲鹏公司，深圳)等体积混合，室温放置6小时。在图7和图8中可见，使用热启动酶 可以有效减少非特异性扩增。 [0105] 实施例6、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 扩增效率的影响 [0106] 本实施例对Hotstart Alpha Taq Polymerase的酶量对miRNA的直接扩增效率做 了分析。从图9中可以看出，Hotstart Alpha Taq Polymerase的活性非常高，20ulPCR体系 中0.0125uL的酶量即可满足扩增要求。 [0107] 实施例7、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 中出现的非特异性扩增的影响 [0108] 本实施例探索了不同用量Hotstart Alpha Taq Polymerase对非特异性扩增的影 响，从图10中可以看出，20uLPCR体系加入0.4uL Hotstart Alpha Taq Polymerase会造成 一定的非特异性扩增；如果酶量降低到〇. 0125UL (如图11)，非特异性扩增会得到很好地抑 制。 [0109] 实施例8、Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA的线性梯度范围 [0110] 本实施例对Direct S-Poly⑴Plus方法检测血浆miRNA的线性梯度范围进行了分 析。将血清RNA进行4倍梯度稀释(总RNA使用量对应的初始血浆的用量为0.1-0.0004ul)，然 后进行检测。从图12看出，Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA (hsa-miR_451a，hsa-miR-21_5p,hsa-miR-126_3p, [0111] hsa-miR-92a_3p，hsa-miR-210_3p，hsa-miR-27b_3p，hsa-miR-103a_3p和hsa-miR-92a-3p)都具有较好的线性相关系数R2 [0112] (0.9139-0.9988)。因此，Direct S-Poly ⑴ Plus方法检测血浆miRNA具有良好的 线性关系和较宽的动态范围。 [0113] 实施例9、Direct S-Poly⑴Plus方法与其他方法比较 [0114] 在本实施例中Direct S-Poly⑴Plus方法将与最为流行的Stem-loop方法和对比 例1中的S-Poly (T) Plus方法做比较。其中Stem-loop和S-Poly (T) Plus的方法是以纯化的 RNA做模板。S-Poly (T) Plus方法同实施例I，Stem-loop方法操作方法则按照试剂盒TaqMan microRNA assay kit (Applied Biosystems)说明书。 [0115] 本实施例中，共用三种miRNA检测方法检测六个miRNA，SPhsa-miR-140-5p，hsa-miR-124a_3p，hsa-miR-16_5p，hsa-miR-93_5p，hsa-miR-25_3p 和 hsa-miR-106_5p。如图 13 所示，除去hsa-miR-16-5p (25 · 43)和hsa-miR-93-5p (27 · 78)的Ct值在S-Poly (T) Plus方法 中略小，其余的miRNA Ct值均在Direct S-Poly⑴Plus方法中最小。Direct S-Poly(T) Plus方法比stem-loop方法灵敏度高出7-342倍(2 · 8-8 · 4个Ct值）。 [0116] 实施例10、Direct S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱 [0117] 在本实施例中，用Direct S-Poly⑴Plus方法做了六个miRNA的单样本验证，内参 hsa-miR-93-5p为归一化标准，使用血浆样本来自于30个健康志愿者和30个结直肠癌病人。 从图 14可以看出，hsa-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p和 hsa_miR-451a 在单 个样本验证中表达量显著上调，hsa-miR-30b_5p表达量显著下调，hsa-miR148a_3p表达量 没有显著变化。 [0118] 对比例2、S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱 [0119] 在本实施例中，为了验证Direct S-Poly (T) Plus方法得出的结论，再次使用3_ Poly (T) Plus进行六个miRNA的单样本验证，外参cel-miR-54为归一化标准，使用血衆样本 同实施例10。从图15可以看出，六个miRNA的表达趋势与Direct S-Poly⑴Plus方法得到的 结果一致。因此，我们可以得出结论，Direct S-Poly⑴Plus方法是稳定可靠的，并且1183-miR-22_3p，hsa-miR-423_5p，hsa-miR-144_3p，hsa_miR-451a 和 hsa-miR-30b_5p 可以作为 结直肠癌潜在的生物标记物。 [0120] 本发明以S-Poly⑴Plus技术为基础，介绍一种灵敏但无需进行RNA提取的miRNA 检测方法，即miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术(Direct S-Poly (T) Plus，简称DSPP)。在 Direct S-Poly⑴Plus方法中，miRNA首先要从蛋白复合物中释放出来，得到粗提的RNA;然 后基于S-Poly⑴Plus方法，粗提RNA在同一反应体系中同时加尾和逆转录。忽略操作时间， 用本发明中的Direct S-Poly⑴Plus方法，cDNA可以在95分钟内制备完成，加上qPCR时间， 140分钟可以完成整个miRNA检测流程。从48个样品中检测1个miRNA，仅需3个小时即可完成 整个操作过程，而提取核酸的方法至少需要一天时间。此项Direct S-Poly⑴Plus技术，将 会极大地简化检测流程、降低成本，更有力的推动循环miRNA肿瘤标志物早日进入临床应 用。 [0121] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。