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专利基本信息

申请号	CN201710442989.5	申请日	2017-06-13
公开（公告）号	CN107385014A	公开（公告）日	2017-11-24
申请公布号	CN107385014A	申请公布日	2017-11-24
分类号	C12Q1/68(2006.01)I	分类	生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程
发明人	苟德明;牛燕琴;康康	申请（专利权）人	深圳大学
代理机构	广州番禺容大专利代理事务所（普通合伙）	代理人	刘新年
地址	518060广东省深圳市南山区南海大道3688号粤海门广场A207
摘要	本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接检测血清或血浆中循环microRNA(miRNA)的实时荧光定量RT‑qPCR方法。所述方法包括：S1：裂解血清或血浆中的外泌体及miRNA蛋白复合体，离心后得到循环miRNA粗提物；S2：miRNA加尾及逆转录；S3：RT‑qPCR定量检测。本发明miRNA直接荧光定量RT‑qPCR扩增方法[Direct S‑Poly(T)Plus,简称DSPP]中，不需要提取核酸，且miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，可在95分钟内完成cDNA的制备。该技术体系灵敏度与stem‑loop方法相比提高数十甚至上百倍，建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的miRNA检测的技术体系。该技术体系尤其适合于临床应用推广及其从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法

技术领域

[0001]本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法。

背景技术

[0002]MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA通过与祀mRNA的3’端非翻译区（3’-UTR)结合，降解祀mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。

[0003]长期以来，基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有poly(A)加尾法（ShiR，Biotechnique·2005，39(4):519-525)和茎环引物（Stemloop)法（ChenC，NucleicAcidsRes.2005,33(20):1-9)。Poly⑷加尾法是利用poly⑷聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly⑷尾巴，然后用含有Olig0(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly㈧加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。

[0004]KangK等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly⑴法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang，K，PloSone.2012.7，e48536.)中进行了公开。在S-Poly⑴方法中，所用引物从5’端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly㈧加尾法和茎环引物法相比，S-Poly(T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升级版的S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号:201510558101.5)，miRNA的Poly㈧加尾和逆转录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly⑴Plus技术又有进一步改进和提高，其总体灵敏度比S-Poly(T)方法提高2-8倍。

[0005]现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。

[0006]可见，现有技术还有待完善。

发明内容

[0007]鉴于此，有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸，更为简便、灵敏、高效、廉价的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，称之为DirectS-Poly(T)Plus(DSPP)。

[0008]为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：

[0009]一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，所述方法不需提纯核酸，将miRNA从蛋白复合体中裂解出来，直接进行RT-qPCR检测。

[0010]进一步的，所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，包含以下步骤：

[0011]S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中的蛋白复合体中释放出来;将所得的混合物离心，得上清即为粗提RNA，40u1的混合物可以吸取约35ul上清；

[0012]S2、加尾逆转录:将所述步骤Sl中所获得粗提RNA进行加Poly(A)尾及S-Poly⑴特异性逆转录；

[0013]S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定量检测。

[0014]进一步的，所述步骤Sl中所述样本用量为20〜50ul。

[0015]进一步的，所述步骤Sl中裂解用试剂包括组分:20ul2Xlysisbuffer、lul蛋白酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。

[0016]进一步的，所述2Xlysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pHS8.0。

[0017]进一步的，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0018]进一步的，所述裂解条件为50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。

[0019]进一步的，所述步骤Sl中的离心条件为：10,000〜14,000g，4°C条件下离心5〜15分钟;优选13，OOOg，4°C条件下离心5分钟。

[0020]进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyApolymerase)和逆车专录酉每（reversetranscriptase)〇

[0021]进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分比为5〜75%，优选40%。

[0022]进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含:0.5-7.5uL上清模板、1±0.2yL的0.5ymol/LRTprimer、l±0.2U的PolyAPolymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的reactionbuffer、RNase_freeWater补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37〜42°C保温50〜70min，74〜76°C保温3〜7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0023]进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：4uL上清模板，IyL的0.5μΜRTprimer，IU的PoIyAPolymerase，100U的MMLV，1·5yL的reactionbuffer，RNase-freeWater补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0024]进一步的，所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-timePCR定量检测，此过程使用的DNA聚合酶为热启动酶，目的是减少非特异性扩增;real-timePCR反应体系为:4XqPCRreactionBuffer:5yL、lymol/LForwardPrimer4yL、10ymol/LuniversalreverseprimerO.10ymol/LuniversalTaqmanprobe0.5yL、100XROXRerferenceDyeO.2μL、hotstartAlphaTaqPolymeraseO.0125yL、cDNA0.5yL、RNase_freeWater加至20yL;反应条件为:预变性95°C5分钟，变性95°CIOs，退火60°C40s，40个循环。

[0025]进一步的，所述热启动酶的制备方法为:将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合，室温放置6小时。

[0026]进一步的，所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清;优选样本为血浆。

[0027]本发明有益效果：

[0028]1、本发明DirectS-Poly(T)Plus方法中，不需要提取核酸的步骤，定量检测miRNA，其流程图如图1所示。操作简便，缩短时间，制备cDNA的时间至少减少70%以上，简便性优于传统方法。

[0029]2、本发明DirectS-Poly⑴Plus方法在逆转录这一步对于模板量要求范围更宽，5%-75%的粗提RNA均可满足逆转录要求，转录效率优于传统方法。

[0030]3、本发明中的技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面，20ul的体液样本就可以实现175个miRNA的检测。

[0031]4、本发明DirectS-Poly(T)Plus方法能从包括血清、血浆/血清、尿液、乳汁、唾液、痰液、粪便抽提上清及细胞培养液等生物体液样本中高效检测miRNA，检测效率比传统方法高出一个数量级，从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。

[0032]5、本发明的简便性、灵敏性和特异性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面有重要应用前景，可广泛用于肿瘤、心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。

附图说明

[0033]图1为miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测流程(DirectS-Poly⑴Plus)。其中，在加尾逆转录体系中，4u1粗提RNA作为模板为最优方案。

[0034]图2为DirectS-Poly⑴Plus方法中不同裂解方案的效果比较。

[0035]图3为DirectS-Poly(T)Plus方法中一步法(加尾和逆转录反应一步完成)和两步法(先加尾后进行逆转录反应)的差别。

[0036]图4为DirectS-Poly⑴Plus方法中起始粗提RNA加入比例。

[0037]图5用DirectS-Poly(T)Plus比较同一志愿者的血清血浆中miRNA表达量。***P〈0·001〇

[0038]图6以提取的RNA为模板，用S-Poly(T)Plus方法比较同一志愿者血清和血浆中miRNA的表达量。用miR-cel-54做归一化内参，*#P〈0.001。

[0039]图7为热启动AlphaTaqPolymerase对DirectS-Poly⑴Plus方法中非特异性扩增减少作用。

[0040]图8为hsa-miR-15b_5p扩增曲线，-RT:不加逆转录酶的阴性对照，检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。

[0041]图9为热启动Alphataqpolymerase用量对miRNA检测Ct值的影响（20ul体系），检测方法为DirectS-Poly(T)Plus。

[0042]图10为使用0.4ulHotstartAlphaTaqPolymerasemiRNA的阴性对照（不加逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。

[0043]图11为使用0.0125ulHotstartAlphataqPolymerasemiRNA的阴性对照（不加逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为DirectS-Poly⑴Plus。

[0044]图12为DirectS-Poly⑴Plus方法的灵敏度和线性范围。

[0045]图13为三种miRNA检测方法灵敏度比较。

[0046]图14为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为DirectS-Poly⑴Plus。数据为土SE，**P〈0·01，***P〈0·001，ns，不显著。

[0047]图15为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为S-Poly⑴Plus(内参为miR-cel-54)。数据为土SE，**P〈0·01，***P〈0·001，ns，不显著。

具体实施方式

[0048]为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

[0049]如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售，所采用的方法均为常规方法，其中引物、探针来自美国IntegratedDNATechnologies(IDT)公司。

[0050]本申请中主要材料来源如下：

[0051]血液来源于深圳市人民医院和北京大学深圳医院。血浆收集流程为:采血于含有EDTA抗凝剂的采血管，4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血浆;全血样本室温放置1小时，取血清4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血清。血清/血浆样本分装为20-50ul的体系，保存于-80°C。

[0052]miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测方法(DirectS-Poly(T)Plus)最优方案流程如图1。在最优的方案中，20ul的血浆可以制备35ul粗提RNA，对应87.5ulcDNA。按照20ulqPCR体系加入0.5ulcDNA，平均可以检测175个miRNA。忽略操作时间，整个miRNA检测流程只需140分钟。

[0053]实施例IDirectS-Poly⑴Plus方法比较血浆和血清中的循环miRNA含量

[0054]在本实施例中，同一志愿者血清和血浆同时作为模板，共收集了同一健康志愿者的血清和血浆样本10对。用本发明中DirectS-Poly(T)Plus方法分别检测等量血清或者血浆样本中的miRNA表达量。具体包含以下步骤：

[0055]Sl、裂解离心，具体步骤为：

[0056]I)20uL血楽_/血清与20uL2Xlysisbuffer混合均勾，加入IuL蛋白酶K，50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟，置于冰上；

[0057]2)13,00(^，4°(：离心5分钟；吸取上清液(粗提1?熟)转移至另一新的离心管中或直接用于S2;

[0058]S2、加尾逆转录:miRNA加Poly(A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0059]所述2Xlysisbuffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pH为8·0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0060]加尾逆转录的反应体系包含：4uL粗提RNA，lyL的0.05μΜRTprimer(逆转录引物），IU的PolyAPolymerase(多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV(鼠白血病逆转录_，1·5yL的reactionbuffer(反应缓冲液），RNase_freeWater(无RNA酶水）补足至10yL。所述reactionbuffer包含以下终浓度的组分：200mMTris_HCl，600mMNaCl，40mMMgCl2,4mMATP，2mMdNTP，pH8.0。加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0061]所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14-20个碱基的PCR通用引物序列、14-20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5-7个与miRNA3’配对的特异性碱基。更优选地，所述S-Poly⑴引物序列从5’端到3’端依次为：16个碱基的PCR通用引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和6个与miRNA3’配对的特异性碱基。[0062]本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase，根据各自序列设计不同的S-Poly⑴引物、上游引物，检测不同miRNA的S-Poly⑴引物序列如表1所示。

[0063]表1、本发明中所使用的引物和探针

[0066]S3、PCR:以步骤S2中逆转录获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-timePCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3-8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly⑴引物的14-20个碱基的通用引物序列。

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