cAMP ELISA Kit

MonoclonalAnti-cAMPAntibodyBased
DirectcAMPELISAKit
(NewNon-acetylatedVersion)
CatalogNo.80203
96WellKit

产品介绍
环磷酸腺苷(腺苷-3’，5’-环化一磷酸，cAMP)能调节各种生理功能，如生物学心血管功能、学习和记忆、嗅觉、免疫反应、哮喘及肾功能(1,2)。cAMP是磷酸二酯酶刺激激活腺苷酸环化酶催化ATP环化形成的，激活或抑制磷酸二酯酶能使cAMP的浓度提高。激活受体的腺苷酸环化酶的阻断剂和cAMP的特定磷酸二酯酶的抑制剂，广泛用于人类疾病。例如，阻断cAMP的运行，使得β-类肾上腺激素受体增加而用于治疗心率不齐、高血压、心肌埂塞和心力衰竭。针对cAMP的特定Ⅱ型和Ⅳ型腺苷酸环化酶的抑制剂，正在进行增强认知方面的临床测试。因此为筛选出腺苷酸环化酶激活剂或磷酸二酯酶抑制剂，需要一个高敏感度、特异性的、可重复的方案用于检测cAMP的浓度。
目前商业化提供的一些cAMP检测试剂盒主要应用ELISA的方案，使用的是非亲和纯化的cAMP多克隆抗体，尽管具有灵敏性，这些多克隆抗体与ATP存在一定程度的交叉反应。基于ATP是cAMP生产的底物，很有必要找到一种能高特异性识别cAMP的抗体。
纽斯特生物开发出了唯一的鼠单克隆抗体的cAMPELISA检测试剂盒。该单克隆抗体对cAMP的特异性比cAMP、ATP等类似的小分子高出108倍以上。相较于其他的多克隆抗体cAMP试剂盒，纽斯特生物cAMPELISA试剂盒能显著的提高其灵敏性和特异性，且能有效避免来自动物多克隆抗体的批次间差异，因此可以提供长久有效地可重复性定量检测。
此外，其他ELISA试剂盒的多克隆抗cAMP抗体与乙酰化cAMP的亲和力明显高于非乙酰化cAMP，本试剂盒的单克隆cAMP抗体与乙酰化或非乙酰化cAMP具有同样的亲和力。因此，纽斯特生物cAMPELISA试剂盒中的样品和标准品不需要乙酰化处理，从而明显缩短了分析时间，有效避免了乙酰化过程中的有机试剂的使用，为大家提供了一个更安全、更健康的工作环境。

实验原理
本试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP的水平。简而言之，将羊抗鼠多克隆抗体包被在酶标板上，细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP与固定数量的偶联辣根过氧化物酶的cAMP或碱性磷酸酶竞争性的结合抗cAMP单克隆抗体，已知的cAMP作为标准品来做标准曲线。经过一段时间孵育，洗掉所有试剂，加入底物进行显色。将多孔板置于酶标仪上，于450nm或405nm波长下，进行读数。黄色的光强度与样品中cAMP的浓度呈反比关系。基于cAMP标准品所得曲线，通过测得的光密度可以计算出样品中cAMP的浓度。

研究背景
cAMP作为独特的第二信使，可调节细胞对各种外源和内源信号分子的反应。它主要通过激活蛋白激酶、控制特定的离子通道、磷酸二酯酶调节细胞环核苷酸浓度以及激活Epac(通过cAMP直接激活蛋白交换)(3-6)来调节生理过程。通过腺苷酸环化酶可以实现ATP转化为cAMP。哺乳动物体内的主要腺苷酸环化酶家族均是横跨膜的，具有9个亚型，且可通过G蛋白Gs或钙离子/钙调素(1)激活。另外，还有一种可溶性的腺苷酸环化酶，可以通过碳酸盐或Ca2+调节(7)。

试剂盒组成材料和试剂
1.羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板一张catalogNo.30101
该微孔板将特异性识别小鼠IgG的山羊抗体包被于可拆分酶标条上。
2.cAMP偶联的辣根过氧化物酶工作液6mLcatalogNo.30102
本包装含1000×偶联酶储存液和稀释缓冲液。
3.抗cAMP的小鼠单克隆抗体工作液6mLcatalogNo.26002-2
本包装含1000×抗体储存液和稀释缓冲液。
注意：为了稳定和长效的实验，抗体储存于-80℃。在使用前将6μL1000×偶联酶储存液加入到6mL稀释缓冲液中配制为工作液，并轻轻混匀。工作液请避免反复冻融。
4.中和液6mLcatalogNo.30103
5.10×浓缩洗涤液15mLcatalogNo.30103
含去污剂的磷酸盐缓冲液。
6.cAMP标准品0.25mLcatalogNo.30203
浓度5000pmol/mL
7.显色底物A，12mLcatalogNo.30107
8.显色底物B,12mL。catalogNo.30108
9.终止液，6mL；catalogNo.30110
注意：该溶液有腐蚀性；储存时请旋紧瓶盖

试剂盒储存要求
本试剂盒所有组分在有效期限内，于4℃稳定保存。为了长效的实验，1000×储液请保存于-80℃。本试剂盒未提供的必需试剂
1.去离子水或蒸馏水。
2.浓盐酸。
3.量程在5μL至1000μL之间的精密移液管。
4.量程为50μL和200μL的中继移液器。
5.用于稀释储液的一次性烧杯。
6.刻度量筒。
7.微孔板振荡器。
8.吸水纸。
9.酶标仪，可读波长450nm，在570nm至590nm之间应有修正。

样品处理
纽斯特生物的ELISA试剂盒适用于检测经过盐酸处理而终止内源性磷酸二酯酶活性的cAMP样品。这种样品可直接应用于检测，而不需要蒸发和进一步的处理。
组织样本需预先冰冻于液氮中。在不锈钢研钵中用液氮将组子样本研磨成精细粉末。待液氮挥发完后，称量冰冻组织样本并加入10倍体积的0.1MHCl混匀。室温以大于600g离心力离心，取上层清夜用0.1MHCl稀释至适当浓度。
对于生长的组织培养液中的细胞，首先移除培养基，然后加入0.1MHCl处理细胞。孵育10分钟并观察细胞是否被裂解；如果裂解不充分，接着孵育10分钟并观察。以大于600g离心力于室温离心，收集上清直接用于实验。临用前在0.1MHCl中加入0.1%至1%浓度的Triton-x100可增强细胞和组织裂解。在这个浓度范围内，去污剂并不干扰试验的结合部位，但是会适度的增加光密度值。含有Triton的样品需利用标准曲线估计浓度，为了最精确的测定，标准曲线需以相同方式稀释。取1mL细胞培养上清加入10μL浓盐酸，600g离心力于室温离心，上清液直接用于实验测定分析。

注意步骤
1.在使用前，将所有试剂放置30分钟，平衡至室温。
2.用试剂预先润洗枪头在使用；取各种样品、标准品和试剂必需更换枪头。
3.移取标准品和样品到微孔底部。
4.从微孔的边缘加入试剂，以避免污染。
5.本试剂盒使用可拆分的微孔酶标条，使用者可根据样品量多少进行拆分。未使用的酶标条保持干燥，密封于试剂盒提供的铝封袋中，于4℃保存。微孔酶标条需安装在相应的框架上使用。
6.在加入显色底物前，确保微孔内没有残留的洗涤液。微量残留的洗涤液可能导致分析结果的变化。

试剂准备
1.非乙酰化cAMP标准品
将5000pmol/mLcAMP标准品溶液平衡至室温。从#1至#6标记六只洁净试管。移取475μL0.1MHCl到#1号试管，400μL到#2至#6号试管。加入25μL5000pmol/mLcAMP标准品到#1管中，剧烈涡旋震荡。从#1管中取出100μL溶液至#2管中，涡旋震荡。以此类推，重复上步操作，梯度稀释至#6管。
经以上操作，#1至#6管中cAMP标准品浓度分别为250,50，10,2,0.4和0.08pmol/mL（详见cAMP实验稀释详情键盘纸）。稀释过的标准品需在30分钟内使用。
标记一只试管作为无标准品空白对照（NSB）。移取600μL0.1MHCl到NSB管中。
2.洗涤液
将15mL10×洗涤液储液加到135mL去离子水中，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至试剂盒有效期限，或者3个月。

实验步骤
使用前将各种试剂取出放置30分钟，平衡至室温。所有标准品和样品必需设置平行对照实验。
快速加入试剂至样品中，立即漩涡震荡2秒混匀。
1.依据实验键盘纸决定酶标条的使用量，将剩余的酶标条连同干燥剂一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。
2.移取50μL中和液至各个微孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
3.移取100μL0.1MHCl至NSB(非特异结合)孔和B0孔(0pmol/mLcAMP标准品)。
4.移取100μLcAMP标准品至相应的孔。
5.移取100μL样品至相应的孔。
6.移取50μL0.1MHCl至NSB(非特异结合)孔。
7.移取50μL偶联酶至各孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
8.移取50μL抗体工作液至各孔中，除了TA(全活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特异结合)孔。
9.将酶标孔置于孔板振动器上，250~500rpm，室温孵育2小时。
10.在吸水纸上拍干微孔内溶液，加洗涤液400μL每孔洗3次，每次需拍干。
11.最后一次洗涤，清空各微孔，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次，以确保没有洗涤液残留。
12.加5μL偶联酶至TA(全活性)孔。
13.每孔200μL显色底物溶液，于室温静置5~30分钟。（显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积混合，并避光放置。）
14.每孔加入50μL终止液。终止后立即读数。
15.清除酶标仪Blank(空白)孔值，读取450nm处的光密度值，在570nm至590nm之间最好有修正。如果酶标仪不能自动清除Blank(空白)孔值，那么手动扣除每个读数的Blank(空白)孔光密度值。

结果计算
样品中cAMP浓度有多种计算方法。X轴表示cAMP标准品浓度，Y轴表示净光密度的平均值或者百分比值。
1样品和标准品的净光密度(OD)平均值的计算：
净OD平均值=OD平均值－NSB孔OD平均值
2计算不同梯度浓度标准品的结合率占最大结合率(B0孔)的百分比，计算公式如下：
百分比值=(净OD平均值/B0孔OD平均值)×100
3绘制净OD平均值或百分比值对cAMP标准品浓度的Logit-Log曲线。通过插值即可得到样品中cAMP浓度。

标准曲线
下面的曲线不能用于计算cAMP浓度。每次实验需新做一条标准曲线。

灵敏度
通过比较10个B0孔平均光密度值(OD)和10个5号管标准品的平均光密度值，计算出灵敏度。cAMP浓度的检测极限通过标准曲线上0位置的两个标准偏差来测定。
OD(B0平均数)=0.685±0.003
OD（5号标准品平均数）=0.604±0.010
光密度偏差(0-0.4pmol/mL)=0.081
2SDsoftheZeroStandard=0.006
灵敏度=081.0006.0/0.8×0.4pmol/mL=29.6fmol/mL
线性关系
cAMP浓度为16.0pmol/mL的样品，用0.1MHCl进行连续七次1:2梯度稀释。将实际的cAMP浓度和测定的cAMP浓度绘制图表。该直线的斜率为1.000，相关系数为0.999。
交叉反应
部分相关化合物的交叉反应由竞争ELISA测定。将可能的交叉反应物溶解到试剂盒分析缓冲液中，浓度从500pmol/mL至500,000pmol/mL。这些样品通过乙酰化在cAMP竞争分析中被测定，通过比较样品中交叉试剂的实际浓度，可以计算出交叉反应，并用百分比(%)表示。