水稻根尖染色体标本制备

1.取材： 选取水稻种子，充分浸种后，将它们摆在铺有滤纸的培养皿内，在约28℃条件下发芽培养，当胚根长至1～1.5cm时，剪下备用。2.预处理 压片法：采用0.1％秋水仙素处理2h左右去壁低渗法可采用以下四种方法处理处理方法 0.002mol/L8-羟基喹啉 α－溴萘饱和溶液 低温（－4℃） 卡诺氏Ⅰ固定液处理时间（h） 1 24 24 24 注：卡诺氏Ⅰ固定液 乙醇：冰醋酸（3：1）3.固定 卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间以不超过24h为宜。经过固定的材料如不及时使用，可经90％酒精换到70％酒精各半小时，再换入一次70％酒精，在0～4℃冰箱内备用。去壁低渗法a.将3固定的材料用DDW洗净后，0.075mol/LKCL溶液室温条件下处理约30min。b.酶解去壁 吸取低渗液，加入1％混合酶液（1％果胶酶与1％纤维素酶的混合液，均为Sigma公司），28℃左右，酶解4.5～5h.酶解过程中，将材料瓶轻轻摇动1～3次，使材料与酶液充分接触。c.后低渗 吸取酶液,用DDW冲洗材料2～3次，然后在DDW中停留30min。d.重固定 吸取低渗液后,加入新配制的卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间约20min。e.标本制备 吸取固定液后，将根尖捣碎,再滴入新鲜固定液3～5滴，制成细胞悬液，充分搅匀。吸出细胞悬液滴于清洁载玻片上。（为了使细胞悬液能充分散开，载玻片可预先放置于－20℃冰箱内保存，使用时取出）再将载玻片于酒精灯下来回移动，烤片。f.染色 改良品红［11］染色30～50min。染色完毕，洗去染液，脱水透明，干燥后镜检。根尖压片法解离: 将1.3固定好的材料用DDW冲洗2～3次，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：DDW 1：11）的小瓶中，在60℃左右水浴锅中处理15min。解离完毕时,根尖分生区是乳白色,而根冠和伸长区则显透明。染色: 将材料水洗3～5次，注意，一定要将解离液冲洗干净，否则材料不易着色。改良品红染色约5h。压片: 取染色完毕的根尖置于干净载玻片上，切除根冠，切下根尖分生区，加入一滴清水，盖上玻片后压片。镜检，如果染色过深，可滴加一滴45％醋酸溶液分色。