【求助】【求助】关于定量elisa到底怎么定量的问题

老师好！各位前辈好！我现在做夹心法定量检测hCG抗原的elisa试剂盒，我以前做过定性的，定量的我不是很清楚，我也咨询了很多人包括同学老师，他们说先定性再定量；然后我就摸索一些实验条件：通过方阵滴定确定了抗原抗体最佳结合浓度，酶标抗体的工作浓度也确定了（酶标抗体是我自己制备的，用的是Innova Biosciences公司的商品化试剂盒，很好标记，而且效价也挺高1:10000稀释），下步就要开始定量了，大概的方法是这样的：就是先将hCG标准品标定至不同的浓度，进行检测，根据OD值和浓度值建立一个标准曲线，得出关系式和变异系数，再由这个标准曲线将待测样品的OD代入关系式就可以定量检测样品中hCG的浓度了，是吗？请各位老师和前辈指点迷经，写的越具体越好，尤其是定量那块，我貌似还是很稀里糊涂的，不胜感激！谢谢！谢谢！

基本上思路是对的，另外要注意与已经商品化的同类型试剂盒的比较，包括用你的试剂盒验证他标准品的浓度、用他的试剂盒验证你的标准品浓度和对同一样本两个试剂盒定量的比较。可以说即使是同一厂家、同一批次的试剂盒测同一样本都不一定一样，所以不要求检测的浓度完全相同，但相互验证的标准曲线应该相同。这一块特别是对用自己表达的蛋白做试剂盒很重要。

展开引用xiashaoshan520 老师好！各位前辈好！我现在做夹心法定量检测hCG抗原的elisa试剂盒，我以前做过定性的，定量的我不是很清楚，我也咨询了很多人包括同学老师，他们说先定性再定量；然后我就摸索一些实验条件：通过方阵滴定确定了抗原抗体最佳结合浓度，酶标抗体的工作浓度也确定了（酶标抗体是我自己制备的，用的是Innova Biosciences公司的商品化试剂盒，很好标记，而且效价也挺高1:10000稀释），下步就要开始定量了，大概的方法是这样的：就是先将hCG标准品标定至不同的浓度，进行检测，根据OD值和浓度值建立一个标准曲线，得出关系式和变异系数，再由这个标准曲线将待测样品的OD代入关系式就可以定量检测样品中hCG的浓度了，是吗？请各位老师和前辈指点迷经，写的越具体越好，尤其是定量那块，我貌似还是很稀里糊涂的，不胜感激！谢谢！不好意思，我还有一个疑问，就是既然要标定标准品的浓度，那为什么还要摸索抗原抗体的最佳反应浓度（当时域）呢？另外当抗原（hCG标准品）处于最佳反应浓度（假设是25mIu）时，OD值基本达到平台期，那么再将hCG标准品标定至50mIu、100mIu、300mIu、500mIu时，OD值一般不会变化，即使变也变不了多少，那样的话还有意义吗?希望各位老师前辈多多指教，越详细越好，谢谢！谢谢！......

基本正确，如果要做的更好，则必须考虑准确度（回收率），精密度等至于你另一个问题，一般来说酶免反应应该是呈S型曲线的，而最佳的检测浓度应该是EC50值附近的浓度，而不是Emax值，所以你OD值达到平台期的样品肯定是测不准的