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1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠 10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠 12.375ml 异硫氰酸胍 118.05g 加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） ▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠 PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲ 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。 ▲ 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加DEPC水270ml，用时现配。 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4℃ 可保持3个月 ▲ 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。 ▲变性电泳缓冲液： 在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml 2.动物组织total RNA的提取 1． 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。 3． 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。 4． 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。 5． 冰浴10分钟。 6． 4°C，12000g离心20分钟。 7． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。 8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。 9． 4°C，12000g离心20分钟。 10． 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。 11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。 12． 4°C，12000g离心20分钟。 13． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。 14． 4°C，12000g离心20分钟。 15． 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。 16． 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。 17． 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。 表 1 Mg# of tissue 500 800 1000 变性裂解液(ml) 5 8 10 2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1 水饱和酚 (mL) 5 8 10 氯仿 (mL) 1 1.6 2 异丙醇(mL) 4 6 8 变性裂解液 (mL) 0.5 0.8 1 异丙醇(mL) 0.5 0.8 1 75% 乙醇(mL) 1 1 1 DEPC-treated H20 (mL) 0.5 0.8 1 3.植物组织total RNA的提取 1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。 2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。 3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。 4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。 5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min 6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。 7. 4℃，12000g离心20min。 8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。 9. 4℃，13000rpm离心15min。 10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。 11. 4℃，13000rpm离心10min。 12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。 13. 4℃，13000rpm离心15min。 14. 弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。 15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。 16. 用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。 17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。 4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO) 1． 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。 2． 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。 3．室温温育10分钟 。 4． 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。 5． 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。 6． 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。 7． 4ºC,12000g离心10分钟。 8． 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。 9． 4ºC，7500g离心5分钟。 10． 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。 11． 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。 表2 组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇 50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml