positive ChIP结果的十个提示 － Chromatrap®

1.染色质质量对于成功的ChIP至关重要。
差的染色质=差的ChIP结果
ChIP测定的成功高度依赖于制备的染色质的质量。染色质制备的3个最重要的方面是裂解，固定和剪切。每个步骤需要完全优化。有关详细信息，请参见下文。

2.始终保持染色质在冰上操作
染色质降解非常快速，特别是在室温下储存或处理时。为了获得最佳结果，确保染色质在整个实验过程中保持在冰上。应避免冷冻/解冻循环。准备储存时最好使用小等分量的染色质，讲有助于防止降解。
 
3.优化细胞固定
蛋白质与DNA的最佳交联确保在分离和ChIP期间保持染色质结构。太短的固定时间将导致交联效率差和在免疫沉淀后导致的DNA损失。如果细胞固定太久，随后的染色质剪切变得抗裂解。这种过度补充可导致背景升高，降低抗原可用性和降低反向交联效率，限制下游信号清晰度。交联的最佳时间将随细胞系而变化。

4.固定溶液必须是新鲜的
确保对于每种染色质制剂的甲醛是新鲜的，给出更可重复的结果。甲醛应无甲醇，甲醇增加细胞膜的通透性导致增加的固定。

5.为您的细胞选择适当的剪切方法超声或酶切
可以使用超声（使用超声波的机械剪切）和酶（微球菌核酸酶消化）剪切。重要的是选择适当的方法。超声处理是一种简单有效的染色质剪切方法，其提供随机片段化的染色质。如果在超声处理过程中控制温度并避免乳化，则可以使用该方法从大多数细胞类型获得良好质量的染色质。如果超声波仪不可用并且对由特异性抗体识别的感兴趣的蛋白质的表位的破坏较小，则酶剪切是有用的。当进行自然nativeChIP（未交联的染色质）时，酶剪切是必需的，因为超声处理可以破坏蛋白质/DNA复合物。某些细胞类型可能对裂解有抗性，导致酶剪切效率差，在这种情况下，应尝试超声处理。Chromatrap®ChIP可以购买超声处理或酶消化试剂。或者，优化染色质制备Chromatrap®包含超声剪切试剂（Cat500239）或酶剪切试剂（Cat500165）的试剂盒。
    
6.确保染色质剪切到100-500bp
对于每个染色质制备，检查染色质剪切为100-500bp之间的片段非常必要。剪切过度或剪切不足的染色质会降低ChIP效率。
染色质的定量分析用分光光度计，荧光计或微流体平台进行。定性分析需要琼脂糖凝胶或微流体平台。Chromatrap®建议在微流体平台上进行DNA定量，该平台提供最大的精确度，并且与Chromatrap®缓冲系统具有理想的兼容性。
 
染色质的过度剪切将导致非常小的片段，其可以减少引物识别和降低PCR效率。通过超声处理的超剪切还可增加损伤蛋白质表位的风险。剪切不足将产生更大的片段，这将增加ChIP测定中的非特异性结合。
超声效率将在细胞类型之间变化，并且可以受样品的交联，加热和乳化的程度的影响。优化超声处理以确保成功的ChIP结果是重要的。使用超声波管比标准塑料微量离心管更有效地传递超声波。开始优化丰富的细胞系或组织样本。这允许优化超声波仪的不同参数，包括功率设置和循环次数。当使用Chromatrap®方法时，使用水浴（4°C）超声仪，在高功率下设置30秒的间隔，30秒的间隔15分钟，观察到成功剪切细胞系和原代细胞以获得片段大小（100-500bp）

对于酶剪切，最重要的因素是细胞膜的裂解和酶的浓度。重要的是优化染色质比例以获得100-500bp之间的最佳片段长度。
通过一系列酶对染色质的稀释，以确定样品中的最佳比例。或者选择酶的浓度，并调整消化时间。Chromatrap®1U每5μg染色质5分钟提供最佳片段长度。对于剪切下的染色质（400bp及以上），尝试增加反应中的U：染色质比率。如果染色质过度剪切（即完全消化为单核小体片段），则酶与染色质比率的量应该降低。

如果细胞膜没有被有效裂解，则该酶对染色质的接触有限。使用相差显微镜检查，以确保所有的核在进行酶消化之前释放。通过在裂解缓冲液中孵育样品更长时间来纠正这种情况。长时间孵育后，如果细胞仍然耐受裂解，转化为超声处理方法。

7.始终使用ChIP验证的抗体
使用高质量和特异性ChIP验证的抗体对于ChIP测定的成功是必要的，未经验证的抗体在ChIP中不能良好地工作。抗体必须识别并结合与DNA结合的天然蛋白质。有必要包括ChIP验证阳性和阴性抗体对照，以确保染色质制备和ChIP方法是适当的。
 
8.始终使用阳性和阴性抗体对照
为了指示免疫沉淀的效率并确保染色质制备是足够的，阳性和阴性对照应当与任何测试抗体一起进行。优质ChIPqPCR（Cat500115/116）和ChIP-seq（Cat500189/190）提供了高丰度组蛋白标记和阴性抗体对照IgG的阳性抗体对照。还包括针对qPCR优化的引物。这些识别甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH），一个管家基因（Barber等人，2005），以确保染色质制备和方法是适当的。或者，可以使用不含第一抗体的“模拟”ChIP反应作为对照来确定背景水平。
除了抗体对照，阳性和阴性基因靶标也是良好的对照，以确保抗体富集是选择性的。

9.获得抗体与染色质的比例
在ChIP测定中，抗体与染色质比率非常重要。不正确的比率可能会影响信噪比。
抗体太多可以饱和ChIP测定，导致非特异性结合。抗体太少不能结合存在的所有染色质，因此不能提供样品中抗体富集的良好表现。已知磁珠和琼脂糖珠在其抗体结合效率方面有所不同。由于Chromatrap®独特的固相平台，我们提供了更大的表面积增强抗体结合能力，促进分子混合能力和将非特异性背景最小化。

在处理ChIP测定中的所有样品以确定最佳抗体：染色质比率之前，对抗体系列进行稀释是重要的。当在qPCR和测序试剂盒中使用小浓度的染色质时，Chromatrap®推荐最佳的抗体：染色质比率2：1。当使用较高浓度（高于10μg）进行测序时，Chromatrap®建议使用5μg抗体，以便节省抗体用量。

10.优化裂解缓冲液
裂解缓冲液通常含有温和的洗涤剂，当在低温下贮存时，可能从溶液中沉淀出来。为了确保裂解缓冲液对于ChIP测定的细胞裂解是最佳的，总是将温热的溶液预温至40℃，偶尔混合或倒置，在使用前除去任何沉淀。确保缓冲液回到室温进行裂解步骤，所有沉淀物重新溶解。
 
当进行染色质制备时，裂解缓冲液的体积很重要。较低的细胞数（1-5百万）比较大的细胞数（10-15百万）需要更少的裂解缓冲液。太多的裂解缓冲液将导致洗涤剂过量，其对抗体结合和一些下游分析具有抑制作用。过量的裂解缓冲液也将导致较低浓度的染色质制备。确保裂解缓冲液体积针对每个染色质制备进行优化，然后进行ChIP测定。Chromatrap®试剂盒具有根据起始细胞数量使用的裂解缓冲液的最佳体积－参见下表。

最佳抗体结合的基本要求是确保染色质不超过总液体体积的10％以上。最佳抗体结合的基本要求是确保染色质不超过总液体体积的10％以上。

	优点	缺点
超声	随机碎片。 适用于难溶裂细胞类型。	通过乳化或过热会导致潜在抗原表位损伤。 需要昂贵的设备。 不能用于自然染色质制备（非交联）。
酶切	温和处理,对感兴趣的表位损害较小。 不需要任何昂贵的设备。 适用于自然染色质制备。	限制酶在片段化期间可能表现出一些序列偏倚。 不适合一些难以裂解的样品类型。

 

Buffer	Cellcount（millions）	BufferVolume（ml）
0.65MGlycine*	1-5	3
	5-10	4
	10-15	5
Hypotonicbuffer	1-5	0.4
	5-10	0.8
	10-15	1.0
Lysisbuffer**	1-5	0.3
	5-10	0.3-0.5
	10-15	0.5-1.0