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Worthington脱氧核糖核酸酶I

IUB：3.1.21.1
C.AS：9003-98-9 

酶促反应 （图像将在新窗口中打开）

牛胰腺脱氧核糖核酸酶是一种核酸内切酶，可优先分裂与嘧啶核苷酸相邻的磷酸二酯键，产生5'-磷酸封端的多核苷酸，在3'位置带有一个游离羟基。DNase I由外分泌腺分泌，在胰腺和腮腺中含量最高。它在其他组织中的含量也较低（Chen和Liao 2006，Nadano等，1993）。 

已知DNase与细胞凋亡有关，并且已经提出DNase在细胞中肌动蛋白聚合的调节中起作用。除了在分子生物学中的应用外，DNase I还被用于治疗囊性纤维化和系统性红斑狼疮（Chen and Liao 2006）。

历史：

1903年，荒木（Araki）用肝，脾和胸腺组织的提取物液化了α-核酸的凝胶（荒木（Araki）1903和Kunitz（1950））。Plenge在微生物中也显示出类似的活性（Plenge 1903）。1913年，德拉·布兰克哈迪埃（De laBlanchardière）开发了一种将胸腺DNA凝胶液化的测定方法，结果表明该方法不伴随DNA碱基的破坏（Kunitz 1950）。

在接下来的几十年中，许多作者描述了可裂解核苷酸的酶，例如核酸酶（Levene和Medigreceanu 1911），核酸凝胶酶（Feulgen 1923），多核苷酸酶（Levene和Dillon 1932），脱氧核糖核苷酸解聚酶（Greenstein 1943），胸腺核苷酸解聚酶（Laskowski 1946）。和脱氧核糖核酸酶（McCarty 1946）。1950年，库尼兹（Kunitz）首次结晶并创造了今天的名称，脱氧核糖核酸酶。  

在1970年代初，Salnikow等人。发现DNase I以四种亚型存在，可通过其唾液酸含量加以区分（Salnikow等，1970）。此后不久，阐明了多肽链结构（Salnikow等人1973b，Liao等人1973和Catley 1973）。Suck和Oefner于1986年以2.0Å的分辨率确定了晶体结构，随后对其进行了精制（Oefner和Suck 1986）。

1990年，从合成的寡核苷酸构建了编码牛胰腺DNase I的基因（bpDNase I），然后在大肠杆菌中克隆并表达了该基因（Worrall和Connolly 1990）。1992年，以2.3的分辨率获得了bpDNaseI-d（GGTATACC）2复合物的X射线结构（Weston等，1992）。1998年，从bp-cDNA克隆了bpDNaseI基因，并在大肠杆菌中表达（Chen等，1998）。

今天，研究人员继续研究与底物结合和催化活性有关的残基（Chen等，2008），新型抑制剂（Chen和Liao，2008），DNAse I对特定DNA序列的特异性（Heddi等，2010）和蛋白质-DNA复合后，DNAse I和DNA均发生构象变化（N'soukpoé-Kossi等，2008）。

特异性：

bpDNase I不是碱基，也不是序列特异性的；但是，它不会随机分裂。它显示出在嘧啶5'侧的裂解倾向，在替代共聚物中尤为明显（Bernardi等，1975； Lomonossoff等，1981）。已经表明，DNase I可以识别出扭转角的变化（Dickerson和Drew 1981）。DNase I的特异性还取决于存在的二价阳离子。在存在Ca2 +和Mg2 +的情况下，它会导致单链断裂，而在存在Mn2 +的情况下，会引起双链断裂（Junowicz和Spencer 1973，以及Campbell和Jackson 1980）。

分子特性：

与人，小鼠和大鼠相似，牛胰腺DNase I基因由9个外显子组成，只有最后8个外显子编码该蛋白（DeMaría和Arruti 2003）。所述新生蛋白质通过由第二外显子编码的22个氨基酸的信号序列导向分泌途径细胞器。主要的活性位点残基H166由第六外显子编码（DeMaría和Arruti 2003，以及Kraehenbuhl等人1977）。尽管在牛和其他哺乳动物物种中外显子的长度几乎相等，但内含子的长度却相差很大。TATA盒序列位于外显子I上游35 bp（DeMaría和Arruti 2003）。已经提出，影响编码序列的多个剪接事件可能是下调DNase I表达的机制（Liu等，1997）。

组成：

bpDNase I存在许多同种型，它们在遗传和唾液酸含量上都不同（Liao 1974，Liao 1981和Chang等1994）。多肽链在Asn-18处被糖基化，由于碳水化合物侧链的唾液酸，显示电荷异质性（Chen和Liao 2006）。 

该酶由于具有扩展的疏水性核心而特别稳定，疏水性核心由两个紧密堆积的六链β折叠薄片组成。它们被八个螺旋和几个环区域围绕，这些环区域由结合的钙原子稳定。该酶通过分子内氢键，盐桥和两个二硫键进一步稳定（Chen and Liao 2006）。

蛋白登录号： P00639

CATH分类（v。3.2.0）：

• 类：Alpha Beta

• 建筑：四层三明治

• 拓扑结构：脱氧核糖核酸酶I；链A 

分子量：  29.1 kDa（理论值）

最佳pH值： 7.8

等电点：  5.08（理论值）

消光系数： 

• 36,750厘米^-1  M ^-1

• E _1％，280 = 11.1

活动站点残留：

• 酪氨酸（Y87）

• 谷氨酸（E100）

• 组氨酸（H156）

激活剂：

• 二价金属离子（Junowicz and Spencer 1973b，Poulos and Price 1972，Price 1969，和Price 1975）

抑制剂：

• 2-巯基乙醇（Laskowski 1971） 

• 2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（Moore 1981）

• 肌动蛋白（Mannherz et al.2008，and Lazarides and Lindberg 1974）

• Alfatoxin B2a，G2，G2a和M1（非竞争性产品）（Schabort 1970）

• EGTA（Moore 1981）和EDTA（Junowicz and Spencer 1973）

• 十二烷基硫酸钠（Liao 1975a）

• 小腿脾脏抑制剂蛋白（Laskowski 1971）

• 碳二亚胺和胆固醇硫酸盐（岩森2000）

• 碘乙酸盐（Moore 1981）

 应用范围：

• 去除原代细胞中的DNA：降低粘度，提供更高的产量

• 生物处理应用中的DNA去除

• 在RT-PCR之前从RNA制备物中去除基因组DNA

• 体外转录

• 尼克翻译

• DNase足迹

• 肌动蛋白结合

• 蛋白质与核酸的紫外线交联

• 放射性标记

Worthington沃辛顿家族的第三代人积极参与这项业务，并继续将其努力和资源专用于公司及其产品系列的发展。沃辛顿（Worthington）有几种无动物源（AOF）的新产品，包括STEMxyme®胶原酶/中性蛋白酶混合物， 肌红蛋白和新等级的B和C型胶原酶。

其他经过使用测试的细胞分离试剂盒：

• 细胞分离优化系统（CIT）

• 肝细胞分离系统（HIS）

• 新生儿心肌细胞分离系统（NCIS）

• 木瓜蛋白酶解离系统（PDS）

特色产品：

• 胶原酶

• 脱氧核糖核酸酶I

• 弹性蛋白酶

• 木瓜蛋白酶

• 核糖核酸酶

• 胰蛋白酶

Worthington木瓜蛋白酶

IUB：3.4.22.2
C.AS：9001-73-4

酶促反应 （图像将在新窗口中打开）

木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸水解酶，在多种条件下均稳定并具有活性。即使在高温下，它也非常稳定（Cohen等， 1986）。番木瓜番木瓜的乳胶是四种半胱氨酸内肽酶的丰富来源，其中包括木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，甘氨酰内肽酶和番木瓜素。这些蛋白质被合成为无活性的前体，在植物受伤和排出乳胶后两分钟内就具有活性。木瓜蛋白酶是次要的成分，但是由于更容易纯化，因此已被广泛研究（Azarkan 2003）。

历史：

1873年，GC Roy在加尔各答医学杂志上发表了一篇题为“木瓜汁对食物中含氮物品的溶剂作用”的文章，首次研究了木瓜蛋白酶的作用。木瓜蛋白酶于19世纪末由Wurtz和Bouchut首次命名，他们从木瓜的汁液中部分纯化了该产品（Menard和Storer 1998）。命名时，它被简单地认为是热带木瓜果实乳胶中的蛋白水解活性成分（Wurtz和Bouchut 1879）。

在整个1950年代中期和1960年代中期，纯化和分离技术得到了极大的改善，并且分离出了纯木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶的研究为理解酶作为蛋白质提供了很大的进步。1968年，木瓜蛋白酶是第二种结晶的酶，其结构通过X射线方法确定。木瓜蛋白酶是第一个鉴定出其结构的半胱氨酸蛋白酶（Drenth et al。1968 ）。

在1980年代，对活动场所的几何形状进行了审查，并确定了三维结构的分辨率为1.65埃（Kamphuis等， 1984）。木瓜蛋白酶的前体和抑制剂在1990年代被广泛研究（Vernet等， 1991）。

今天的研究旨在进一步了解特异性（Portaro等， 2000）和抑制剂，低pH，金属离子和氟化醇带来的结构扰动（Alphey和Hunter，2006； Huet等， 2006； Kaul等， 2002）。 ，Naeem et al。2004）。

特异性：

木瓜蛋白酶具有相当广泛的特异性。它具有内肽酶，酰胺酶和酯酶活性。活性位点包含七个亚位点（S ₁ -S ₄和S _1' -S _3'），其可以各容纳一个氨基的基板的酸残基（P ₁ -P ₄和P _1' -P _3'）（谢克特和伯格（1967）。特异性由S _2亚位点控制，S _2亚位点是容纳底物P ₂侧链的疏水口袋。木瓜蛋白酶显示出特定的底物偏爱性，主要是针对该亚位点上的大量疏水或芳香残基（Kimmel和Smith，1954）。S ₂以外 对于亚位点偏好，在活性位点内缺乏明确定义的残基选择性。

分子特性：

所有木瓜蛋白酶的成熟形式都在212至218个氨基酸之间，并表现出很强的同源性（Azarkan 2003）。X射线结构分析表明它们采用相同的三维折叠（Pickersgill 等，  1991； O'Hara 等，  1995； Maes 等， 1996）。

木瓜蛋白酶是作为酶原而合成的，具有133个氨基酸的N端区域，而不是活性酶的一部分（Cohen 等人，  1986年）。木瓜蛋白酶前体基因prepropapain已被克隆并部分或整体表达（Cohen 等人 1986和Choudhury 等人2009）。 

组成：

木瓜蛋白酶是具有三个二硫键和一个酶活性必需的巯基的单链多肽。木瓜蛋白酶被表示为无活性的前体，propapapain。活性木瓜蛋白酶的形成需要几个切割步骤，包括首先切割18个氨基酸的前区（信号序列），然后进一步切割糖基化的114个氨基酸的前区（Vernet 等，  1995）。该前区用作内在的抑制剂和折叠模板。有关更多详细信息，请参见Revell 等。 1993，泰勒 等。 1992年，和Cohen 等人。1990年。 

蛋白质登录号：  P00784

CATH分类（v。3.2.0）： 

• 类：Alpha Beta

• 建筑：Alpha-Beta建筑群

• 拓扑：组织蛋白酶B；链A

分子量： 

• 23.4 kDa（理论值）

最佳pH值：  6.0-7.0

等电点：

• 8.88（理论上）

消光系数： 

• 53,610 cm ^-1 M ^-1  （理论值）

• E _1％，280 = 22.88（理论值）

活动站点残留：

• 半胱氨酸（C158）

• 组氨酸（H292）

• 天冬酰胺（N308）

激活剂：

• 半胱氨酸

• 硫化物和亚硫酸盐

• 重金属螯合剂，如EDTA

• N-溴琥珀酰亚胺

（White and White 1997） 

抑制剂：

• 永磁同步电机

• TLCK，TPCK

• ALPH 2巨球蛋白

• 汞²⁺和其他重金属

• 原子能机构

• 止痛药

• 胱抑素

• E-64

• 亮肽素

• 巯基粘合剂

• 羰基试剂

• 烷基化剂

         （White and White 1997）

 应用范围：

• 细胞分离，其中它比其他蛋白酶更温和的（即：皮层神经元，视网膜，和平滑肌）

• 蛋白质结构研究，肽图分析

• 红细胞表面修饰，用于抗体筛选或鉴定

• 从IgG和IgM抗体制备Fab

• 整合膜蛋白的溶解

• 由纯化的蛋白聚糖生产糖肽

• 酶创清创术

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