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TaKaRa的Poly(A) Polymerase还有销售。
JIAOYUE TaKaRa的Poly(A) Polymerase还有销售。问题是我已经买了NEB的。
lynx302 请问谁用过NEB的 E.coli Poly(A) Polymerase ,我用来给RNA末端加A， 谁有详细的加尾步骤，以前用的TaKaRa的， 步骤跟NEB的不一样。恳请用过的人指教。lynx302您好，以下是NEB E.coli Poly(A) Polymerase的protocol，您可以参考一下。Poly(A) protocolThis is the protocol to be used for the poly (A) tailing of RNA.10X Poly(A) reaction buffer 2 ul final concentration 1×10 mM ATP2 ul final concentration 1mMRNA(~0.1 uM) Poly(A) Polymerase(10 U) MQ water to a final volume of 20 ul Incubate for 10 minutes at 37 C.以上需要用到的反应缓冲液和ATP均随酶提供。
图2：在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
二、常见问题及解答Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败? A1：反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？A2：感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。重组子太大（>10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。 Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？A3：内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。Q4：使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1％。 Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？ A5：T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。Q6：T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？A6：可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。Q7：T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？A7：单位定义用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10 μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。Q8：T4 DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mM ATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer 3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。Q9：T4 DNA连接酶可以热失活吗？A9：可以，65 °C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB# M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015 Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。
二、关于NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答1、产品特性介绍以及使用方法产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。应用：DNA片段克隆入载体 文库构建 TA克隆 Linker连接 线性DNA的再环化 快速连接试剂盒的优点： 快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成 方便-可在室温条件下进行连接反应 灵活-适合于各种常规连接反应 试剂盒成分：Quick T4 DNA 连接酶(重组酶) 2X Quick Ligation Buffer 贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%甘油。2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM ATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH 7.6@25°C。* 美国专利号：4,582,802。注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。 快速连接步骤:混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 µl。 加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。 加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。 稍事离心，室温 (25°C) 作用5分钟。 冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。 不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。 转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：冰上融化感受态细胞。 在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 µl)的连接混合物冷却。 在DNA样品中加入50 µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。 冰上放置30分钟。 37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。 加入950 µl室温培养基，37°C温育1小时。 取100 µl样品铺在适宜的培养基上。 37°C培养过夜。 注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2× Quick Ligation Buffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 µl。DNA片段体积大于10 µl的，则相应增加2× Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。