蚂蚁淘解析：逆转录聚合酶链反应（RTPCR）

一、总RNA的提取 

总RNA提取可以：（1）获得高纯度、高质量的总RNA；（2）可以满足生物学下游实验NorthernBlot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR和阵列分析所需。

实验方法和原理：

GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

二、CDNA第一链的合成 

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。蚂蚁淘现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystem forFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例介绍一下cDNA第一链的合成：

1． 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH₂O使总体积达11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心；
 

2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
 

3． 取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA  2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min；

4．加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min；
 

5． 于70℃加热15min以终止反应；
 

6．将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
 

三、PCR 

1．取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl；
 

2．加入适量的ddH₂O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心；
 

3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
 

4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
 

5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。