StressMarq细胞培养测定

以下协议用于生成用1型和2型alpha突触核蛋白预制原纤维（PFF）处理的神经元的ICC图像。当用1型α突触核蛋白PFFs治疗时，原代大鼠海马神经元显示出路易体包涵体形成，而当使用2型α突触核蛋白PFFs治疗时则没有。

1. 从出生后第1天的Sprague Dawley大鼠幼仔中收获海马神经元，并以每孔80,000个细胞的平板接种在聚D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的平板上。

2. 在处理之前，将预制的原纤维在水浴超声仪中超声处理1小时。

3. 用预制的原纤维以4 µg / mL处理神经元。维护有车辆的对照井。

4. 7天后，所有孔均进行了50％的培养基更换。

5. 更换培养基后7天（处理后体外第14天），所有孔均用4％甲醛固定20分钟。

6. 用过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤三次（每次10分钟），以洗去甲醛。

7. 然后将细胞用1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（LiCOR，927-40010）和30 mL / mL的0.1％triton-X 100封闭30分钟。

8. 30分钟后，将在1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（含30 mL / mL的0.1％triton-X 100）中稀释的第一抗体添加至孔中，并于4度孵育过夜。

9. 第二天，用三遍过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤每次抗体溶液（每次10分钟）。

10. 将二抗稀释在1：1 PBS：LiCOR Odyssey Block（含30 mL / mL的0.1％triton-X 100）中，并在黑暗中加入孔中60分钟。

11. 60分钟后，用三遍过滤的10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤洗出二级抗体溶液（每次10分钟）。

12. 然后将板在落射荧光显微镜（Olympus IX73，B＆B Microscopes）上以20倍物镜成像。

13. 以相同的固定比例和相同的曝光时间捕获所有图像。

蚂蚁淘生物是一家专门从事抗体,蛋白,细胞等试剂产品研发与销售的公司.蚂蚁淘生物专业代理StressMarqX 品牌试剂,大量现货,保证正品,价格优惠.欢迎来询

StressMarq蛋白质印迹协议该蛋白质印迹方案应作为每个研究人员建立自己的方案的指南，因为每种试剂都需要针对特定物种，组织类型和应用组合进行优化。块在1X TBST中使用5％脱脂奶粉作为封闭缓冲液。使用过量的封闭缓冲液以完全覆盖印迹。在室温下摇动阻塞1小时。 洗在1X TBST中3 x 4分钟，然后在1X TBS中3 x 4分钟。确保盒子中始终有过量的清洗缓冲液。 一抗孵育稀释TBST中的一抗。在室温下在振荡器上孵育2小时。偶尔检查印迹以确保其被抗体溶液充分覆盖。 洗在1X TBST中3 x 4分钟，然后在1X TBS中3 x 4分钟。确保盒子中始终有过量的清洗缓冲液。 二抗孵育用1X TBST准备第二抗体（浓度取决于所使用的抗体）。在室温下在振荡器上孵育1小时。偶尔检查印迹以确保其被抗体溶液充分覆盖。 洗在1X TBST中3 x 4分钟，然后在1X TBS中3 x 4分钟。确保盒子中始终有过量的清洗缓冲液 侦测用于印迹的ECL检测试剂的体积取决于印迹的大小。通常，您只需要在移印液上用移液管吸取足够的溶液，使其覆盖即可。以1：1的比例混合溶液A和B。用镊子拾起污点，然后轻轻地将边沿紧贴着金边擦拭，以吸干污点中多余的Tris。将污点放在新的（干净的）盒子中，然后将检测试剂吸到污点上，以使其均匀覆盖。孵育印迹（在黑暗中）5分钟。用镊子捡起污点，并用擦布擦干多余的试剂。对印迹成像。