Innova新品——Conjugate Check&Go!Kit

查看完整版本请点击这里：【求助】ELISA结果分析:为什么样品稀释后的OD反而高用DBI的核蛋白抽提试剂盒,样品分别2倍,5倍稀释.RD的ELISA试剂盒测定NFKB P65但测定结果为什么5倍稀释的OD值反而高?几个样品都存在这种情况,实验已经两次重复,而且标准曲线很好.非常困惑中,初做ELISA,请高手指点...在线等待,不胜感激....查看完整版本请点击这里：【求助】ELISA结果分析:为什么样品稀释后的OD反而高我也来说两句查看全部回复ending (2014-1-08 15:32:12)我想可能两倍稀释时有其他杂质和包被的样品反应了，而这种杂质有不和最终的结合物质反应。Ao7 (2014-1-08 15:32:29)谢谢楼主回答.你是说样品的问题,存在非特异结合,对吧.可是我不同处理间的趋势很好,这样的数据可以用吗?还有什么好办法解决这个问题?继续求助中.....KGZ564 (2014-1-08 15:32:48)样品是样品稀释液稀释的，所以不应该存在样品污染的问题。ELISA测定的时候，存在着一个线性范围的。当第一抗体被抗原饱和后抗原浓度增加不会提高被捕获靶抗原的量，所以样本中靶抗原浓度在一定范围内是线性相关。在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量呈现一个曲线。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。可能你样品中抗原量过多了，超过了抗体的结合能力，所以出现稀释后，OD增大现象。我觉得稀释后的数值可能更加可信。Ao7 (2014-1-08 15:33:12)多谢楼主.5倍稀释后的OD在0.2左右,那我再稀释一下,8倍或者10倍,测定看看.理论上两次测定的值应该差不多的.实际上是否有这样的量化关系呢,请高手指教...zwsyrt (2014-1-08 15:33:31)稀释两倍并不代表在包被的时候，吸附的蛋白就会比稀释5倍的高，从你的实验结果来看，应该就是这个问题了。也就是说，你的稀释倍数影响了蛋白的包被效率，从而导致实验结果与预期的不一致，此外，也不应该说稀释两倍，蛋白浓度高就一定能包被相同量的蛋白上去，反而稀释5倍就一定低，楼主做这个实验只能证明你的蛋白在稀释5倍的条件下，包被效率更高，并不能说明其他问题。panda王 (2014-1-08 15:33:53)QUOTE:原帖由 zwsyrt 于 2014-1-8 15:33 发表 bbcodeurl(http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif, \)稀释两倍并不代表在包被的时候，吸附的蛋白就会比稀释5倍的高，从你的实验结果来看，应该就是这个问题了。也就是说，你的稀释倍数影响了蛋白的包被效率，从而导致实验结果与预期的不一致，此外，也不应该说稀释两倍，蛋白浓度高就一 ... 板孔所能吸附的蛋白量是有限的过多的蛋白进行包被的话，反而可能因为蛋白浓度过高，导致抗原表位被“block”，从而降低了后面抗原抗体复合物形成的量，OD值不仅不会升高，相反会降低。Ao7 (2014-1-08 15:34:29)多谢两位的回答。我做这个实验是检测下不同处理条件对NFKB P65表达的差异。只是在测定时每个样品采用了两个稀释倍数。但对于同样的稀释倍数下，不同处理间的差异很显著，难道不可以说明不同处理条件下该因子的表达是有差异的？“楼主做这个实验只能证明你的蛋白在稀释5倍的条件下，包被效率更高，并不能说明其他问题。”是什么意思呢？在不超过板孔最大吸附量的情况下，包被效率直接反映的是蛋白浓度，对否？另外还有一个问题，各位高手做ELISA时设置阴性对照吗，考虑样品提取液是否对结果有影响呢？H2O (2014-1-08 15:34:56)QUOTE:原帖由 Ao7 于 2014-1-8 15:34 发表 bbcodeurl(http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif, \)多谢两位的回答。我做这个实验是检测下不同处理条件对NFKB P65表达的差异。只是在测定时每个样品采用了两个稀释倍数。但对于同样的稀释倍数下，不同处理间的差异很显著，难道不可以说明不同处理条件下该因子的表达是有 ... 其实表达差异应该用RT-PCR来做，而不是用ELISA，当然ELISA在一定程度上也可以定量，就看你提取的目的蛋白的纯度了，因为抗原包被存在一个过量包被的过程，在板孔里面能包被上的并不一定全部是你的蛋白。但是如果你所买的试剂盒中已经包被了一抗，那么你就可以对你的表达目的蛋白进行定量检测，这样可以从OD值中反映出你表达蛋白的浓度。你只是做反了。。。ELISA不需要做阴性对照，因为这是严格的抗原抗体反应，并不是非特异性交联。不过需要做的是阳性对照，这样可以对你的样品孔进行定量检测。一般我们包被时，在板孔里加入蛋白的量都是过量的，这样保证蛋白能够被吸附上去，因此包被效率只是相对板孔质量而言，（当然，这只是我个人理解，如果有不对的地方，请各位战友批评指正）。样品提取液只是对你提取蛋白过程中，所能得到的目的蛋白的总量有影响，一般最后溶解目的蛋白的量时，请参照标准程序或试剂盒，无需担心！查看全部回复我也来说两句

Innova Biosciences近期推出ConjugateCheck&Go!Kit，可检测抗体是否与荧光素结合完好，操作简便，快速。
 
产品特点
● 使用方便，操作简便快速，仅需10min
● 不需要昂贵的设备
●InnovaBioscience独家技术
● 节约结合物，只需提供40μl稀释好的结合物
●可检测使用Lightning-Link®荧光标记试剂盒,InnovaCoat®GOLD以及LATEX标记试剂盒产生的标记抗体
● 可检测其他任何荧光标记的抗体结合物







ConjugateCheck&GoKit的使用：将提供的试剂条插入含有少量结合物的孔中，结合物沿着消化纤维素膜，会与ProteinA和ProteinG结合, 等待10min,当看到有一个条带出现时，即表明抗体结合成功。
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2014年1月8日其实表达差异应该用RT-PCR来做,而不是用ELISA,当然ELISA在一定程度上也可以定量,就看你提取的目的蛋白的纯度了,因为抗原包被存在一个过量包被的过程,在板孔里面...