蚂蚁淘知识库：一文了解CRISPR热潮

科学家们有望利用一种细菌免疫机制开发出革命性的新型基因组编辑技术（genome-editing technique）。
 

细菌虽然不会对我们真核生物产生太多的同情之心，但是它们也的确是会生病的。而且细菌得病也不是和我们人类毫无关系的，至少就会对乳制品业带来很大的影响，因为在生产酸奶和奶酪的过程中都会用到嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）这样一类细菌。嗜热链球菌能够将奶中的乳糖（lactose）分解成乳酸（lactic acid）。可是噬菌体（bacteriophages，简称phages）却会让这些细菌“生病”，极大地影响酸奶等乳制品的生产质量。
 

2007年，Danisco这家来自丹麦哥本哈根的食品原料公司（现在该公司已经被 DuPont公司收购）的科学家们发现了一种方法，能够极大地增强工业细菌对噬菌体的抵抗力。他们的方法就是用噬菌体来免疫细菌，结果取得了很不错的效果（Science , 23 March 2007, p. 1650）。DuPont公司收购了 Danisco公司之后，利用这种技术培育出了抵抗力更强的工业生产用菌。而且这项工作还证明，细菌也是拥有适应性免疫系统（adaptive immune system）的，而且依靠这种免疫机制抵抗同一种噬菌体的多次攻击。
 

很快，其他并非从事食品科学和微生物研究的科研人员也意识到了这种细菌免疫机制的重要价值，因为他们发现这种细菌免疫机制有一个特点，那就是能够针对特定的DNA序列发挥作用。今年的1月，有四个课题小组都报道称他们对这种细菌免疫机制进行了成功的应用尝试——对人类细胞里的特定基因进行了定向破坏。科学家们将这种技术称作CRISPR技术。在随后的8个月里，更多的实验室也开始使用这种技术，对人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母细胞、线虫和多种农作物进行了大量的试验，成功地对基因进行了定向缺失、插入、活化或抑制等遗传改造操作，从各个方面证明了CRISPR技术的潜在应用价值。虽然生物学家们最近也开发出了几种新方法，可以对基因进行更加精确的操作，但是美国哈佛大学（Harvard University）的 George Church认为，CRISPR技术的高效率和易用性还是其他技术无法匹敌的。Church的实验室是世界上首批使用CRISPR技术成功对人类细胞进行遗传改造的实验室之一。
 

科学家们可以使用CRISPR技术，用比以往快得多的速度构建人类疾病的小鼠动物模型，也能以更快的速度对基因进行研究，而且还可以一次对细胞内的多个基因进行遗传学改造，研究这些基因之间的相互作用。虽然伴随着近年来逐渐流行起来的的CRISPR技术狂潮，也慢慢暴露出了这项技术的一些不足和限制，使这股热潮进一步蔓延的速度有所减退，但是Church和其它的CRISPR技术先驱们还是坚信，这项技术有着美好的前景，他们还组建了公司，希望能够利用CRISPR技术治疗各种遗传性疾病。美国蒙大拿州立大学波兹曼分校（Montana State University in Bozeman）的生化学家Blake Wiedenheft就评价道：“我还没有发现在哪个领域内，有哪种技术能够像 CRISPR技术这样发展得如此迅猛。”
 

在短短的8个月之内，科学家们已经利用CRISPR技术成功地对线虫（左）、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行了遗传学改造，获得了更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，这些成果都表明CRISPR技术在动物基因改造方面有着巨大的应用潜力。
 

艰难的开始

这种新技术最早可以追溯到1987年，当时有一个科研小组观察到，在细菌编码的一个基因末端有一段非常奇怪的重复序列。不过当时这个发现并没有引起太多人的关注。直到十年之后，越来越多的生物学家们开始从事微生物基因组的解析工作，这时他们也都发现了这种奇怪的现象，即在细菌的基因末端，一段 DNA序列会紧接着一段它自己的反向序列，然后再接一段大约30bp左右的、貌似是由碱基随机排列而成的DNA序列，科学家们称之为“空格DNA（spacer DNA）”，然后再紧接着一段与前面DNA序列相同的DNA片段，之后再接另外一个空格DNA。在一个微生物的基因组中，这种情况可以出现好多次，不过每一个奇怪的序列都可以由不同的重复片段和空格片段组成。在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）中都能够观察到这种现象，于是科学家们给这种序列取了一个名字，叫作CRISPR，即成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。
 

起初，很多科研人员都认为这种CRISPR序列是毫无价值的垃圾DNA，可是在2005年，有3个生物信息学课题组报道称，这些 CRISPR序列里的空格DNA总是能够与噬菌体的 DNA序列互补、匹配，这提示我们， CRISPR序列很有可能与细菌的免疫保护机制相关。 “这是一条非常重要的线索。 ”美国加州大学伯克利分校（University of California, Berkeley）的生化学家Jennifer Doudna这样评价道。于是，美国马里兰州美国国家癌症生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information in Bethesda,Maryland）的Eugene Koonin等人提出了一个新想法，即细菌和古细菌能够吸收噬菌体的DNA，然后将其留作己用，并转录出相应的RNA，与入侵的外源DNA结合，这有点类似于真核生物采用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）机制。
 

Danisco公司的研究人员 Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath等人在2007年发现，他们只要对嗜热链球菌进行一番遗传学改造，插入或者去掉几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力。不过现在已经来到美国北卡罗莱纳州立大学（North Carolina State University in Raleigh）工作的Barrangou当时并没有充分意识到CRISPR机制巨大的应用潜力，他说道：“我们当时完全没有想到，这些DNA序列可以被用于基因组改造方面的工作。”
 

目前分别就职于德国 Helmholtz感染性疾病研究中心（Helmholtz Centre for Infection Research）和德国Helmholtz医学院（Hannover Medical School in Germany）的Doudna和Emmanuelle Charpentier则分别把工作往前推进了一步。他们俩各自对不同的 CRISPR相关蛋白进行了研究，了解了这些蛋白的作用，阐明了DNA空格序列在细菌的免疫防御机制中的具体作用机制。不过他们俩很快就都把目光锁定在了Cas9这种蛋白上，因为依赖Cas9蛋白的CRISPR系统要比其它 CRISPR系统更简单。
 

当有外源的噬菌体入侵时，细菌的 CRISPR系统就会被激活，将空格DNA和重复 DNA序列转录成一个长链RNA分子，然后细菌会将该长链RNA分子切割成短链的、包含空格DNA序列的小RNA分子（short spacer-derived RNA），我们称之为 crRNA。

Charpentier团队发现，有一种名为tracrRNA的RNA分子与Cas9蛋白共同作用，负责生成 crRNA，该成果发表在了2011年的《自然》（Nature）杂志上。Charpentier等人推测， Cas9、tracrRNA和crRNA一起能够降解与 crRNA互补的外源DNA分子。
 

Doudna和Emmanuelle Charpentier都发现，Cas9蛋白是一种能够降解DNA分子的核酸酶（nuclease），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双螺旋中的一条链。而且这两个课题组还发现，他们可以在不破坏Cas9蛋白与特异性DNA靶点结合能力的前提下，使Cas9蛋白中的一个、或者两个酶切位点失活，该研究成果对于将CRISPR系统应用于基因组改造工作意义重大。据 Doudna回忆，仅仅需要一种酶，再搭配各种 RNA就够了，这种技术要比之前的方法简单多了。
 

不过在 CRISPR技术投入使用之前， Doudna和Charpentier的课题组都必须证明，他们能够非常精确地控制Cas9蛋白的切割位点，确保不会发生脱靶的情况。Doudna的博士后Martin Jinek提出了将tracrRNA和空格 RNA组合起来，形成一个所谓的“向导RNA分子（single-guide RNA）”的想法，并且他们课题组已经在去年成功地构建出了好几个这种向导RNA，而且将其与Cas9蛋白混合在一起，成功地对特定的DNA位点进行了切割（Science , 17 August 2012, p. 816）。 “这篇文章可谓是一篇里程碑式的论文。”Barrangou评价道。
 

该试验表现出的精准的靶向特性一下子让众多科研人员对CRISPR技术产生了浓厚的兴趣。遗传工程师们一直以来都希望能够对各种生物进行基因插入，或者删除的操作。但是他们一直无法在基因组中进行精确的定位，因此不能在特定的位点进行这种基因改造。十年前，科学家们开发出了锌指核酸酶（zinc finger nucleases），该蛋白拥有两个人工组合在一起的结构域，它可以依靠其中的 DNA结合结构域（DNA-binding domains）结合到基因组中特定的位点上，然后再依靠其中的酶切结构域将该位点的DNA链切断。该技术诞生之后也掀起了一股热潮，甚至有人成立了公司，专门以该技术为平台开发艾滋病治疗手段（Science , 23 December 2005，p. 1894）。最近又出现了另外一种基因组改造工具，那就是TALEN人工核酸酶，这是一种比锌指核酸酶更方便的基因组定向改造工具，并且有可能会彻底取代锌指核酸酶（Science, 14 December 2012, p. 1408）。
 

现在， CRISPR系统又大有彻底压倒 TALEN核酸酶的趋势。 CRISPR系统是以 RNA作为基因组定位工具，而锌指核酸酶和 TALEN核酸酶则都是以人工开发的特异性 DNA位点结合蛋白作为基因组定位工具。我们都知道，合成RNA要比合成蛋白质容易得多，所以Barrangou评价道：“用CRISPR技术只需要几个星期就可以拿到确定的实验结果，可人工核酸酶技术至少需要好几个月。”
 

CRISPR技术的优势

方便、快捷并不是CRISPR技术的唯一优势。Church的课题组一直都在致力于将 TALEN核酸酶应用于人体细胞的改造工作，但是当他了解到Doudna和Charpentier等人的工作之后，他们立刻尝试了CRISPR技术，构建了一段特异性针对某个位点的RNA分子，尽管他们早已拿到了针对同一位点的TALEN核酸酶。Church等人用三种人类细胞系进行了试验，结果发现CRISPR技术的效率要比 TALEN技术高得多，而且采用CRISPR技术可以对更多的基因进行遗传学改造（Science, 15 February, p. 823）。为了更进一步证明 CRISPR技术的优势，Church课题组甚至构建了一个向导RNA文库，合成了数万条向导 RNA，这些RNA分子能够特异性地与90%的人类基因结合。“有了CRISPR技术，你可以对人类基因组进行任意操作。”Church这样说道。
 

这就意味着，我们几乎可以利用 Cas9蛋白对任何一个基因进行遗传学改造，既可以利用Cas9蛋白的核酸酶功能将DNA链切断，使基因失活；也可以将DNA链切断之后在该位点插入一个新的基因。美国马萨诸塞州坎布里奇博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的合成生物学家Feng Zhang的文章几乎与Church的论文在同一时间发表。Zhang等人发现，采用 CRISPR技术可以同时对人类细胞里的两个基因进行特异性的切除（Science, 15 February, p. 819）。接下来，Zhang又与美国马萨诸塞州坎布里白头研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge）的发育生物学家Rudolf Jaenisch合作，一次性破坏了小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell）里的5个基因。
 

这些工作为将来构建突变小鼠（这是生物学研究工作中急需的科研材料）打下了很好的基础。因为运用此技术可以将经过人工遗传改造过的小鼠胚胎干细胞培育成小鼠胚胎，再继续发育成突变小鼠。但是Zhang等人找到了一种更便捷的方法，他们将编码Cas9蛋白的 mRNA和两条向导RNA分子直接注入了小鼠的受精卵细胞当中，同样成功地敲除了两个基因，成功率达到了80%。他们还能够进行更加精细的基因组学改造操作，比如控制Cas9蛋白的酶切活性，使其只能够在DNA链上切开一个小口，而不能将其彻底切断，这样就可以借助同源重组修复机制（homologydirected repair）在被切开的位点插入一个新的基因，该研究成果已经于今年的5月 2日发表在了《细胞》（Cell）杂志上。
 

目前，构建一种小鼠动物病理模型需要经过多轮精心的育种试验，耗时至少1年，可是使用Zhang等人的CRISPR方法，只需要数周的时间就足够了。Zhang认为，这种方法应该不仅限于小鼠这一种动物，对其它动物应该也能取得同样好的结果，他说道：“只要我们能够对动物的胚胎进行遗传学操作，再将改造过的胚胎植入母体内，那就应该就能够得到转基因动物，甚至可能得到转基因的灵长类动物。”
 

在Zhang和Church的文章上线3周之后， Doudna课题组和一个来自韩国的科研团队也合作发表了一篇文章，Doudna等人成功地用 CRISPR技术对人类细胞进行了DNA切割操作。与此同时，另外一个科研小组则成功地用 CRISPR技术得到了一种突变的斑马鱼。这一系列的文章吸引了整个生物研究界的注意力。美国杜克大学（Duke University in Durham, North Carolina）的生物医药工程师Charles Gersbach评价道：“如果只是一篇文章，那么可能只会引起一部分人的关注，可是一下子出来了6篇文章，那每个人都会想：‘看来我也得做这个了。’”
 

为DNA“动手术”的外科医生。科学家们发现，仅仅由向导RNA分子和Cas9蛋白组成的CRISPR系统就可以对基因组中特定的DNA序列进行外科手术式的精细改造，在特定的位置敲除、或者插入基因。最近还有人发现，对Cas9蛋白进行修饰之后还可以对特定的基因进行抑制（如左下图所示）或者激活（如右下图所示）操作。
 

中国科学院北京遗传及发育生物学研究所（Chinese Academy of Sciences’Institute of Genetics and Developmental Biology in Beijing）的Gao Caixia也是在一年前看过 Doudna和Charpentier等人的文章之后坚定地投靠了CRISPR系统。之前，Gao的团队一直是在使用锌指核酸酶和TALEN核酸酶对水稻和小麦等农作物进行遗传学改造工作。现在由于使用了CRISPR技术，她们已经成功地让四种水稻基因失活了，这意味着CRISPR这种技术也可以用于对水稻这种至关重要的粮食作物进行遗传学改造的工作。Gao等人还用CRISPR技术敲掉了一个小麦基因，结果得到了耐白粉病（powdery mildew）的小麦新品种。Gao等人于今年的8月在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上发表了文章，介绍了她们用CRISPR技术对植物进行遗传学改造的成果，与此同时，也有其他4篇文章得以发表，分别介绍了用CRISPR技术对植物和大鼠进行遗传学改造的工作。
 

上图展示的是经CRISPR技术改造过的水稻。就在本月（2013年8月）早些时候，科学家们成功地用CRISPR技术对水稻等植物进行了遗传学改造，图右展示的就是基因被敲除之后的水稻，可见某个基因被敲除之后，水稻变得矮小、苍白。
 

此外，使用CRISPR技术还非常便宜。比如针对特定基因设计向导RNA的软件就是免费的；在美国马萨诸塞州的坎布里奇，还有一个叫做Addgene的机构，他们向学术科研机构提供用于构建CRISPR系统的DNA分子，只收费65美元，因为有11个科研团体向 Addgene机构提供可用于构建CRISPR系统的DNA序列。自今年初至今，Addgene已经向全世界提供了5000多个CRISPR序列，而且仅仅在7月的一个星期之内，他们就收到了 100多份订单。Addgene的执行负责人Joanne Kamens说道：“CRISPR系统现在是最火爆的科研技术。”
 

基因活性调控功能

最初发表的有关CRISPR系统的文章，介绍的全都是如何利用CRISPR系统切割DNA的工作。但是很快，科研人员们就发现了 CRISPR系统的新功能。美国加州大学旧金山分校（UC San Francisco）的Lei S. Qi等人与Doudna合作，发明了类似于RNAi技术的 CRISPRi技术，能够以可逆的方式使基因失活，这种技术在研究基因功能方面潜力巨大。 Qi等人主要对Cas9蛋白进行了改造，这些 Cas9蛋白同样能够在向导RNA的带领下与特定的DNA序列结合，但是不会切断DNA链。在细菌细胞里，Cas9蛋白就足以抑制基因的转录，但是在哺乳动物细胞内，Qi等人又在Cas9蛋白上额外添加了一个抑制子，用来抑制基因的活性。此时的向导RNA主要与靶基因上游的调控序列——启动子区域结合。
 

就在上个月，Qi团队和另外三个科研小组使用携带了一个人工合成的转录因子（能够启动基因表达的蛋白）的Cas9蛋白，成功地激活了人体细胞基因组中下游靶基因的表达。他们发现，使用1种CRISPR的效率比较低，不过他们已经想到了解决这个问题的办法。据这四个课题组负责人之一的Gersbach介绍，他们针对启动子区域里的不同位点，设计了多个向导RNA分子，结果就看到了非常明显的协同效应。
 

“我还没有发现在哪个领域内，有哪种技术能够像CRISPR技术这样发展得如此迅猛。”

——美国蒙大拿州立大学Blake Wiedenheft
 

Gersbach在今年7月25日出版的《自然方法》（Nature Methods）杂志上发表了一篇文章，文章介绍了他们激活的多个与多种人类疾病相关的基因，包括与肌肉细胞分化、肿瘤与炎症，以及胎儿血红蛋白生成作用相关的基因。另外两个课题组也对生物医学意义重大的多个基因进行了遗传学操作。据Gersbach介绍，利用CRISPR技术对这些基因进行改造，可以治疗镰状细胞贫血、关节炎等多种疾病。
 

当然，CRISPR技术也不是尽善尽美的，也存在一定的局限和缺陷。比如我们现在就不清楚向导RNA分子的特异性作用机制。据美国波士顿市麻省总医院（Massachusetts General Hospital in Boston）的J. Keith Joung介绍，他们的原始试验数据显示， CRISPR技术也存在明显的脱靶效应（off-target effect）。Joung在今年的1月也发表论文介绍了利用CRISPR技术对斑马鱼胚胎进行基因改造，并用CRISPR技术活化基因表达的工作。Joung的工作显示，与向导RNA序列类似的非靶点DNA片段也能够被切断、激活或 者失活，即存在明显的脱靶效应。
 

Joung的科研团队在实验中发现，向导 RNA分子还能够与靶点序列不同的非靶点序列结合，非靶点序列与靶点序列的碱基差异可以达到5个之多。虽然Zhang等人的结果稍好一点，但是他也认为，特异性问题是一个必须解决的问题，尤其是在如今大家都迫切地希望用CRISPR技术治疗人类疾病的大背景之下。 Zhang表示，如果要确保CRISPR技术的安全性，就必须保证CRISPR分子只能够与目的序列结合，绝不能与非目标分子结合。
 

同样地，我们也必须保证CRISPR系统的组份能准确地到达目标位置。Joung强调说： “CRISPR系统的输送问题也是一大难题，这应该与被作用的细胞，或者作用物种有关。”比如对于他们使用的实验对象斑马鱼，就采用了直接在斑马鱼的胚胎中注入向导RNA和编码Cas9蛋白的mRNA的方法。可是对于哺乳动物细胞，他们使用的则是DNA分子。如何让CRISPR系统进入成体动物，或者用于治疗身患疾病的人类患者，这还都是需要仔细思考的问题。
 

最终，根据实际遗传学操作的需要， CRISPR技术和锌指核酸酶，以及TALEN核酸酶都会找到属于它们自己的一席之地。但是目前，大家都还是被CRISPR技术的简便、易用特性，以及无限的应用潜力所吸引。 Charpentier等人正在其它细菌中寻找Cas9蛋白的变异体，希望找到一种更好用的Cas9蛋白。微生物学家们也在利用CRISPR系统对细菌进行改造，以抑制耐药基因的进一步扩散。 Church、Doudna、Charpentier，以及很多科研人员也都成立了与CRISPR技术相关的公司，探索CRISPR技术在包括基因疗法在内的治疗人类疾病方面的价值。
 

除此之外，CRISPR技术还有很多其它非常有价值的应用方向。Barrangou就认为，目前CRISPR技术面临的瓶颈就是人类的想象力太有限了。
 

细菌受感染之后启动的这套机制还真不赖。
 

原文检索：

Elizabeth Pennisi. The CRISPR Craze. Science, 23 August 2013; DOI: 10.1126/science.341.6148.833