蚂蚁淘大讲堂：Sage Science核酸片段回收系统在RADseq中的应用

1.什么是RAD-SEQ?RADseq(Restriction-siteassociatedDNAsequencing，限制性酶切位点相关的DNA测序)是通过对基因组进行酶切，并针对带有酶切位点的DNA相关片段进行测序，这项技术能够低成本的开发大量SNP标记，不受有无参考基因组和染色体倍型的限制。2.它的应用在哪方面?RADseq技术在动植物的群体进化研究，遗传图谱构建和QTL定位，以及全基因组关联分析上得到了广泛的应用。其优势应用是非模式物种的生态与进化研究中的SNP查找与基因分型研究。
 

3.RAD-seq的种类?

1. RestSeq（restrictionfragmentsequencing）：限制性酶I酶切+连接接头+限制性酶II酶切+片段选择建库测序；
2. ezRAD:一个或多个常见酶酶切+Illuminate建库Kit建库测序；
3. SLAF-seq（specific-lo­cusamplifiedfragmentsequencing）：酶I酶切+barcode+酶II酶切+接头建库测序；
4. 2bRAD:IIB限制性酶单酶切，IIB型限制性内切酶能在识别位点的上游和下游位点分别切断，获得固定长度的片段。构成33–36bp插入片段建库测序；
5. ddRAD（double-digestrestriction-site-associatedDNA）：两个限制性酶酶切，接头分别与一种酶配套+切胶进行片段选择建库测序；
6. SBG(sequence-basedgenotyping)：稀有酶和一个或两个常见酶酶切+PCR选择性扩增短片段序列建库测序；
7. MSG（multiplexedshotgungenotyp­ing）：常见酶单酶切+片段选择建库测序；
8. GBS（genotypingbysequencing）：常见酶单酶切+PCR选择性扩增短片段序列建库测序；
9. RRL（reducedrepresentationlibrary）：平性末端酶酶切+片段选择建库测序；
10. originalRAD（originalrestriction-siteassociat­ed-DNA）：限制性酶单酶切+机械打断建库测序；
11. CRoPS（complexityreductionofpolymorphicsequences）:两个酶酶切+AFLP产物建库测序；

    
    4.RAD-seq 文库构建过程中，DNA片段大小筛选的重要意义?

    酶切可以将基因组简化为很多DNA片段。而片段大小筛选步骤可以进一步减少需要进行基因分型的基因位点。筛选潜在的特征性基因座位，主要依赖于两酶切位点距离。不同测序文库间片段筛选的一致性，对产生不同样本间可对比的基因座位至关重要，进而直接影响后续的生物信息分析和应用。片段筛选的方式有直接筛选和间接筛选。直接筛选包括手工切胶，磁珠筛选和pippin，但不同的技术手段，其精确性不同。下图为不同技术手段的简单比较。手工切胶是根据最左边的Marker对照切割，即使是同一个人操作，也很难保证每个泳道，每个样品目的范围的一致性。磁珠纯化的片段范围过于宽泛，无法进行聚焦。相比于手工切胶和磁珠纯化，pippin自动化片段回收的一致性和准确性更高，重复性和精确度均达到95%以上。在ezRAD，ddRAD文库构建过程中，pippin片段回收的一致性，是实验成功的关键因素，ddRAD的创始人BrantPeterson博士认为“即使在手工切胶最佳的实验案例里，生信分析后发现，手工切胶的效果也仅为pippin仪器的一半”。自2011年第一代产品PippinPrep发布以来，已陆续推出BluePippin、SageELF、PippinHT、SageHLS等多个型号，SageScience在核酸片段回收领域已成为领导性品牌。环亚生物科技有限公司是美国Sage公司中国区总代理商，一直关注测序相关设备在国内的引进和开发，致力于协助国内客户更好、更快完成测序样本的制备工作，实现更高效率、更轻松的工作流程。公司网站：www.apgbio.com参考文献：AndrewsKR,GoodJM,MillerMR,etal.HarnessingthepowerofRADseqforecologicalandevolutionarygenomics.[J].NatureReviewsGenetics,2016
    Peterson,B.K.,Weber,J.N.,Kay,E.H.,Fisher,etal.DoubledigestRADseq:aninexpensivemethodfordenovoSNPdiscoveryandgenotypinginmodelandnon-modelspecies.[J].PLOSONE,2012