Rockland Dr.Moncada 分享： 如何获得更漂亮的流式结果

1.  如何降低背景
 
流式细胞实验优化过程中的一个关键步骤是试剂（抗体）的滴定。为了达到最佳效果，实验者必须确定抗原结合达到饱和所需抗体的最低量。这将帮助实验者提高荧光信号特异性和强度，同时尽量降低背景。如果需要同时使用多色时，滴定这一步骤也可以让实验者发现一抗和二抗之间意想不到的交叉反应。
 
2.如何选择对照
 

MouseIgG2aIsotypeControlFluorescein010-0241

千万记得设置与标记抗体同型的阴性对照，实验者可以通过该对照确定实验背景的信号强度。尤其是直标一抗或一抗和PE（phycoeryhtrin）标记的二抗组合时尤为重要。为获得最佳效果，请设立未染色的细胞样品组（与染色样品同时培养），这样便于控制由于自发荧光而产生的背景。有可能的话，用已知表达目的抗原的细胞以及已知缺乏目的抗原的细胞，将有助于确定所用抗体的特异性。 
 
 3.优化通透和固定步骤，从而提高胞内蛋白的检测效率

检测细胞内的目的蛋白更具有挑战性，因为它们具有超出抗体特异性的额外的要求，包括成功穿过可透细胞膜的能力。细胞固定和通透的优化是需要凭经验的一项重要环节，目的是平衡胞内结构的完整性与细胞通透性。使用新鲜配制的高纯度低聚甲醛用于固定，并开始加入温和去污剂（即吐温20）用于通透。如果需要进一步改进固定和透化步骤，请逐渐提高甲醛浓度到4％或尝试乙醇或甲醇，并使用其它洗涤剂包括的TritonX-100，或在没有固定或酒精固定情况下使用皂甙。
 
 4.死细胞染色，为获得更有意义的活细胞数据。
 
由于死细胞可以非特异性的结合任何抗体，因此这些数据必须从有效数据中去除。要做到这一点，最好的方法是使用某种荧光染料，通过受损的细胞膜，将死细胞染色。在大多数情况下，尤其是做细胞内指标染色实验时，这种染料最好是共价结合来染色死细胞，而不会因为细胞通透而泄漏。

5. 保持高荧光强度
当进行的细胞表面标记物染色时，请注意胞外抗原由于抗体结合而内化的现象。这种自然发生的现象可以对你的荧光信号的强度产生显著的负面影响，但可以通过下面方法改善：

1. 使用无聚合抗体的溶液；
2. 将样本始终放在冰上或冰箱里；
3. 使用含叠氮钠的染色缓冲液，确保染色时细胞代谢活性降低。也可考虑使用F(ab)片段这种形式的单价抗体。