双抗系列—Xencor XmAB平台研究报告

作者 lalpharesearcher

“单抗看靶点，双抗看平台。”这是业内对于抗体领域研发常见的总结，顾名思义双抗的开发主要在于其是否具有核心的双抗组合平台技术。

本系列旨在与大家分享一些有特点、有意思的双抗平台。

Xencor简介

Xencor于1997年成立于加州，是一家专注于抗体类产品开发的生物技术公司。其有多个Fc区域改造用于开发不同功能抗体的技术平台，包括bispecific fc、immune inhibitor fc、cytotoxic fc以及xtend fc功能技术平台。

本文着重介绍其bispecific fc双抗技术平台。

双抗初体验—第一代双抗平台mab-Fvs

双抗根据结构来区分，可以分为对称性和不对称性；含有Fc区域以及不含Fc区域等类型。含有Fc区域有诸多优点如：延长半衰期、保有FcR功能以及便于纯化等。

Xencor的第一代双抗技术平台就是，含有Fc区域的异二聚体结构平台（图1）。其结构为，N端带有抗体A的scFv区域，两条链的C端则分别带有抗体B的VL以及VH区域，通过改造的Fc CH3区域形成异源二聚体的形式。

图1. 第一代双抗平台结构示意图

Fc CH3区域的改造是基于计算机结构模拟，得到的氨基酸突变位点库加以实验验证得到的。通过分别突变两个抗体CH3区域的S364H/F405A以及Y349T/T394F区域（HA-TF）。

通过Fc CH3区域HA-TF型的突变，其双抗表达异源二聚体的为89%，但是其CH3区域的稳定性有较大程度的下降，从天然IgG1的Tm =83℃下降至69℃（图2）。

图2. 第一代双抗平台突变位点、异源二聚体得率以及热稳定性

基于这个平台技术所开发的双抗在体外，具有表现出了其双特异性的结合活性以及功能（图3）。

图3. 第一代双抗平台抗体HER-CD3mAB-Fv所介导的细胞杀伤效应

尽管如此，基于其差强人意的异源二聚体形成率以及较差的稳定性，Xencor几乎推倒重来开发了第二代双抗平台。

第二代双抗平台—XmAb

第二代平台的设计更加从工业化的角度出发，进行Fc区域的改造。其核心要素为两点：1. 基于等电点改变，便于异源二聚体纯化的Fc区域改造；2. 基于提高异源二聚体形成率以及保持Fc区域稳定性的改造。

另外，其靶向部分也从N端C端的scFv-Fv组合，改变为了N端Fab-scFv，为什么做这个改变并不清楚也许是出于稳定性的考虑（图4）。

图4. 第二代双抗结构示意图

基于等电点变化的位点突变

首先我们来看看基于等电点（pI）的改变的，Fc区域改造。双抗CMC过程中纯化是一大挑战之一，要从性质接近的混合物中分离得到目标的双抗是一个难点，通过pI的改变，造成同源二聚体杂质与目标异源二聚体有较大的pI不同，可以通过离子交换层析简单的将目标蛋白分离纯化。

Xencor通过计算各位置氨基酸的表面暴露程度，避开其功能位置区域如proteinA结合位点、FcR结合位点等。将高度暴露的氨基酸替换成其同配位氨基酸（如图五所示）。

图5. 各位点表面暴露程度分析

通过N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D位点的突变的抗体pI显著的降低，同源二聚体（两条链皆突变）、异源二聚体（一条链正常另一条突变）以及正常抗体（两条链皆无突变）的pI分别为6.0、6.4以及7.3，较大的等电点差距能够通过离子交换简单快速的等到目的异源二聚体产物。此外，这些位点的突变，并未明显的降低其结构的稳定性，其CH2和CH3区域的Tm 值分别为69.1℃和82.7℃，相对于天然的IgG1的71.4℃和82.9℃变化不大。但是仅仅基于这样的改造，细胞表达中异源二聚体的形成率仅约50%，需要进一步的改造提高其形成率。

基于异源二聚体形成的位点突变

提高异源二聚体的位点突变的前提是需要保证不影响其pI以及尽量的减少其稳定性的变化。所以其位点的突变和改造，依据净等容（net isovolumetric）的原则进行（图6）。

图6. 异源二聚体和相应的同源二聚体副产物的侧链体积和侧链电荷的变化

通过一系列的筛选以及结果分析，发现两条链E357Q/S364K以及L368D/K370S的突变能够将目的异源二聚体的形成率提高至95%，并且其稳定性也有较好的保证，CH2和CH3区域的Tm 值分别为 69.6℃和76.4℃。通过与其他已有的技术平台比较，Xencor在异源二聚体得率以及稳定性方面具有明显的优势（如图7所示）。

图7. 现有技术平台的数据比较

基于pI改造以及异源二聚体形成改造的XmAb技术平台，目的产物的得率能够达到60%以上（图8），基于XmAb平台的双抗功能以及活性分析数据在此就不一一列举了。

图8. CLD以及downstream示意图

小编点评：

双抗的开发已成为兵家必争之地，几乎所有的抗体研发公司都会通过自主研发或合作的形式开发双抗。Xencor的XmAb技术平台很有其特点和优势，目前已有多个双抗推向临床阶段，尽管近期Xencor的CD123-CD3双抗XmAb14045在I期临床试验造成两例患者死亡，但小编并不认为这是其平台的问题，应该是在双抗设计和优化的问题，等有更多的数据后再做分析。